柑橘果肉、果皮中酚类物质含量差异性研究

黄胜佳，叶霜，熊博，刘新亚，徐颖欢，董志翔，汪志辉，2*

1(四川农业大学 园艺学院，四川 成都，611130) 2(四川农业大学 果蔬研究所，四川 成都，611130)

柑橘(Citrus)为芸香科(Rutaceae)柑橘亚科(Subfamilyaurantioideae)植物[1]，是全世界种植最多的水果之一。橙类是世界栽培最广泛的柑橘种类，分为甜橙、脐橙、血橙等[2]，具有非常高的营养价值。杂柑是由橘和橙(或柚)杂交而成，兼有橘和橙(或柚)的优势[3]。

柑橘果实富含能参与人体新陈代谢、调节有关生理活动、对人体保健和疾病防治有重要作用的生物活性物质[4-5]。果蔬中富含酚类物质，其中类黄酮约占2/3，酚酸约占1/3[6]。近年来研究表明，酚类物质具有抗炎[7]、抗氧化[8]、抗过敏、抗癌、抗突变、抑菌等重要作用[9]。目前，对不同柑橘品种酚酸和类黄酮的含量差异研究主要集中于柚类[10-12]、金柑[13]、宽皮柑橘以及柑橘幼果[14]，对名、特、优、新且在水果市场具有广阔发展前景的杂柑以及橙类进行比较、分析的报道较少。

本研究在前人基础上[15-17]，通过优化HPLC条件，在保证检测酚类物质多元化的同时，样品前期处理简单、操作简便，无需繁琐的提取步骤，且检测时间短，检测限、精密度和回收率方面的效果优良。本试验对四川主栽杂柑和橙类中10种酚类物质的含量进行测定，探讨不同柑橘品种果肉、果皮中酚类物质含量的差异，分析其规律。

1 材料与方法

1.1 材料

选取生长健壮、树势树形基本一致、株行距为3 m×4 m、中等管理水平的口之津32号、沃柑、金诺、黄果柑、春见、晚红血橙、塔罗科血橙、奈维林娜脐橙为试材。在果实成熟期，每株树按树冠外围的东、南、西、北、中5个部位采样，每个部位随机采取中等大小、无病虫害无畸形的3个果，采回后将果皮、果肉分离，置于-80 ℃冰箱中冷冻保存备用。

标准品：柚皮素(naringenin)、柚皮苷(naringin)、新橙皮苷(neohesperidin)、咖啡酸(caffeic acid)、芥子酸(sinapic acid)、绿原酸(chlorogenic acid)、阿魏酸(ferulic acid)、没食子酸(gallic acid)、芦丁(rutin)和对羟基苯甲酸(p-hydroxybenzoic acid)，均购自Sigma公司，纯度均在98%以上。甲醇、甲酸和乙腈均为色谱纯，购自麦克林公司；实验用水为超纯水。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理

从-80 ℃冰箱中取出冻成块的果皮、果肉，将其敲碎后混匀，分别取果皮和果肉至研钵中，加入液氮研磨成粉末后，准确称取0.5 g混合样放入2 mL离心管中，避光条件下加入1.5 mL提取液[V(甲醇)∶V(水)∶V(甲酸)=70∶28∶2]，充分混匀。将离心管放入超声装置中辅助提取30 min后，在4 ℃、5 000 r/min离心条件下离心15 min。取出离心管，吸取上清液。用0.45 μm微孔滤膜过滤，贮存于-20 ℃冰箱中，用于酚酸及类黄酮的分析。

1.2.2 标准曲线的绘制

用甲醇(色谱纯)将每瓶定量的20 mg标准品分别溶解，定容于10 mL棕色容量瓶中，配制成2 g/L的标准品母液。全程都进行避光处理，将上述母液用流动相分别配制成0.25、0.5、1、2、5、10、25、50、100 mg/L的浓度梯度，再配制成混合标准溶液，避光保存于-20 ℃以下的环境中[17]。

将上述混合标准溶液进行色谱分析，以标样的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制出10种酚类物质的标准曲线，并且计算出回归方程和相关系数。

1.2.3 色谱条件

使用安捷伦1260液相色谱仪，C18色谱柱(5 μm，4.6 mm×150 mm)，柱温30 ℃，进样量20 μL。流动相：A为甲酸溶液，体积分数为10%，B为乙腈，梯度洗脱，流速为1 mL/min，洗脱程序表1所示。

表1 流动相配比与洗脱时间Table 1 Flow matching ratio and elution time

柚皮苷、新陈皮苷、柚皮素用283 nm波长检测，咖啡酸、芥子酸、绿原酸、阿魏酸用320 nm波长检测，没食子酸用280 nm波长检测，对羟基苯甲酸用260 nm波长检测，芦丁用367 nm波长检测[18-21]。由于本实验所用安捷伦1260仪器的检测器只能在方法中设置波长，而不能自动检测并调整到最适波长，所以在测定前需对波长进行系统设置。芦丁和芥子酸出峰时间相近，对羟基苯甲酸和绿原酸出峰时间相近，虽在样品中能准确分离，但无法准确设置切换波长的时间，即检测时1个样测定2次，第1次共检测280, 320，283 nm三个波长，在此条件下能检测出咖啡酸、芥子酸、绿原酸、阿魏酸、柚皮苷、新橙皮苷、柚皮素、没食子酸。第2次检测260 nm和367 nm波长，在此条件下能检验出对羟基苯甲酸和芦丁。

1.3 数据分析

试验数据用IBM SPSS 19.0软件，以p<0.05为显著水平，对结果进行统计分析；用IBM SPSS 19.0软件，进行维度的偏好性分析。

2 结果与分析

2.1 酚类物质标准品色谱分析

图1为混合标准品55 min内分别在280、320、367、283 nm波长下的色谱图。根据保留时间的不同，峰依次为没食子酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、芥子酸、芦丁、柚皮苷、新橙皮苷、柚皮素。由图1可知，9种酚类物质出峰较好，可满足多种酚类物质的同时分离。图2为对羟基苯甲酸在260 nm波长下的色谱图。由于对羟基苯甲酸出峰时间在7 min左右，与绿原酸出峰时间相近，无法准确设置切换波长的时间，故分开来测定。由图2可知对羟基苯甲酸出峰较好。

图1 混合标样在不同波长下的色谱图
Fig.1 Chromatogram of mixed standard samples at different wave lengths

图2 对羟基苯甲酸在260 nm波长下的色谱图
Fig.2 Chromatogram of p-hydroxybenzoic acid at 260 nm wave length

2.2 HPLC分析方法的考察

2.2.1 线性关系及检出限

将混合标准溶液配制成不同浓度在色谱条件下进行测定，根据色谱图计算回归方程、相关系数、线性范围和检出限。由表2可知，各标准品的浓度与峰面积呈现出良好的线性相关，相关系数达到0.999 1～1，准确度较高。且检出限低于0.03 μg/g，满足酚酸和类黄酮的检测分析。

表2 酚类物质的标准曲线回归方程、相关系数、线性范围、检出限Table 2 Regression equations, correlation coefficients, linearity range, detection limit of phenolic compositions

2.2.2 精密度试验

将50 mg/L混合标准溶液按1.2.3的色谱条件重复进样6次，根据各标准品的峰面积计算标准溶液的标准偏差(RSD)以确定该色谱方法的精密度。咖啡酸、芥子酸、绿原酸、阿魏酸、没食子酸、芦丁、柚皮苷、新陈皮苷、柚皮素、对羟基苯甲酸的RSD值分别为0.89%、0.92%、0.38%、0.82%、1.90%、0.96%、1.12%、1.00%、0.73%、0.61%。各物质的RSD介于0.38%～1.90%，说明该方法具有很好的精密度。

2.2.3 重复性试验

准确称取同一份样品6份，按1.2.1的样品前处理方法将样品做相同处理后，在1.2.3的色谱条件下将进行测定，根据峰面积计算各样品中酚类物质的含量，并计算得出RSD值。咖啡酸、芥子酸、绿原酸、阿魏酸、没食子酸、芦丁、柚皮苷、新陈皮苷、柚皮素、对羟基苯甲酸的RSD值分别为3.42%、3.45%、3.44%、2.42%、2.84%、2.85%、1.88%、3.16%、2.75%、3.52%，10种酚类物质的RSD值均小于3.52%，表明该测定方法的重复性良好。

2.2.4 稳定性试验

将处理好的待测溶液分别在0、2、4、6、8、12、24、36、48 h进样，测定样品中10种酚类物质含量。样品中咖啡酸、阿魏酸、绿原酸、芦丁、柚皮苷、对羟基苯甲酸、柚皮素保留时间和含量的RSD值均小于4.69%，表明在48 h内稳定性良好；芥子酸、没食子酸、新陈皮苷保留时间和含量的RSD值在12 h内小于4.22%，表明其在12 h内稳定性良好，应在12 h内完成测定。

2.2.5 加样回收率试验

准确称取已知含量的样品6份，根据样品中各酚类物质含量确定各标样的添加量，分别加入一定量的混合标准溶液，进行回收率实验。结果如表3所示，平均回收率为90.26%～118.85%，RSD为0.96%～3.01%，表明该试验方法准确度较高。

表3 回收率试验结果Table 3 Results of recovery

2.3 柑橘果实中酚酸物质含量的测定

2.3.1 柑橘果肉中酚酸含量的测定

由表4可知，不同柑橘品种果肉中酚酸含量组成差异较大，在杂柑和橙类果肉中均检测到了咖啡酸、没食子酸和对羟基苯甲酸；在橙类和口之津32号果肉中均未检测到阿魏酸；只有塔罗科血橙、奈维林娜脐橙和黄果柑检测到了芥子酸；除金诺外其他品种中均检测到了绿原酸。

表4 不同柑橘品种果肉中酚酸含量 单位：μg/g 鲜重

注：表中所有含量均以鲜质量计。同列数据后字母不同表示处理间差异显著(p<0.05)。表5、表6、表7同。

不同柑橘品种果肉中同一种酚酸的差异较显著，口之津32号果肉中咖啡酸的含量为6.027 5 μg/g，显著高于金诺、晚红血橙和沃柑等，其中奈维林娜脐橙最低，为2.338 4 μg/g；奈维林娜脐橙和黄果柑果肉中芥子酸的含量显著高于其他品种，分别为1.632 8、1.535 3 μg/g；塔罗科血橙果肉中绿原酸的含量为11.345 5 μg/g，其次为黄果柑和奈维林娜脐橙，显著高于其他几个品种；金诺和春见果肉中阿魏酸的含量分别为1.316 2 μg/g、1.289 6 μg/g，显著高于其他品种；果肉中没食子酸的含量以金诺最高，为4.076 7 μg/g；在不同柑橘品种果肉中，对羟基苯甲酸的含量差异显著，含量为2.116 1～3.033 8 μg/g。

2.3.2 柑橘果皮中酚酸含量的测定

由表5可知，口之津32号果皮中总酚酸含量最高，其次依次为沃柑、晚红血橙、春见、金诺、奈维林娜脐橙、塔罗科血橙、黄果柑。在橙类果皮中，塔罗科血橙的芥子酸含量最高，其次依次为奈维林娜脐橙、晚红血橙，显著高于其他杂柑；另一方面，从不同柑橘品种果皮中主要酚酸物质组成含量分析，口之津32号和金诺果皮中酚酸以咖啡酸为主，其次为绿原酸。塔罗科血橙、晚红血橙、沃柑、奈维林娜脐橙果皮中酚酸以绿原酸为主，其次为咖啡酸。在春见和黄果柑果皮中，酚酸主要以绿原酸为主，其次为没食子酸；从不同柑橘品种果皮中同一酚酸物质的含量差异方面分析，口之津32号果皮中咖啡酸含量(98.888 8 μg/g)显著高于其他几个品种，奈维林娜脐橙、春见、黄果柑中含量最低。塔罗科血橙果皮中芥子酸含量为12.088 8 μg/g，显著高于其他几个品种，其中口之津32号和黄果柑中最低；沃柑果皮中绿原酸含量最高，达100.860 μg/g，显著高于其他几个品种，黄果柑中仅有22.174 9 μg/g。

表5 不同柑橘品种果皮中酚酸含量 单位：μg/g 鲜重

2.4 柑橘果实中类黄酮含量的测定

2.4.1 柑橘果肉中类黄酮含量的测定

由表6可知，在8种果肉中均检测到了芦丁，均未检测到新橙皮苷和柚皮素；本试验测定的8个品种果肉中类黄酮以芦丁和柚皮苷为主，柚皮苷含量最高的为沃柑，达14.407 3 μg/g。口之津32号、金诺和春见果肉中并未检测到柚皮苷。金诺果肉中芦丁含量最高，为18.799 1 μg/g，最低为口之津32号，仅1.295 0 μg/g。

表6 不同柑橘品种果肉中类黄酮含量 单位：μg/g 鲜重

2.4.2 柑橘果皮中类黄酮含量的测定

表7为不同柑橘品种果皮中类黄酮含量，在果皮中均检测到了芦丁、柚皮苷和新橙皮苷，而柚皮素仅在沃柑和黄果柑中检测出来，沃柑果皮中柚皮素含量显著高于黄果柑；与果肉中芦丁含量相似，金诺果皮中芦丁的含量显著高于其他7个柑橘品种，达165.904 4 μg/g。橙类果皮中芦丁含量显著低于其他6种杂柑，塔罗科血橙、晚红血橙、奈维林娜脐橙的含量依次为5.439 9、30.492 5、10.062 5 μg/g；沃柑果皮中柚皮苷和新橙皮苷的含量最高，分别为19.792 9、13.931 4 μg/g，显著高于其他品种。

2.5 柑橘酚类物质的聚类分析

对柑橘果肉和果皮中的酚类物质进行维度的偏好性分析，结果如图3所示。图3-a为果肉中酚类物质维度的偏好性分析，由图3-a可知在柑橘果肉中，阿魏酸、芦丁和没食子酸与金诺的距离较近，表明金诺与其他柑橘品种相比，果肉中阿魏酸、没食子酸和芦丁的含量最高；其他7个柑橘品种没有明显的分布规律。

图3-b为果皮中酚类物质维度的偏好性分析，由图3-b可知，咖啡酸、阿魏酸、对羟基苯甲酸与口之津32号的距离最近，口之津32号果皮中3种酚酸的含量显著高于其他柑橘品种，说明这3种酚酸与口之津32号联系较紧密；新橙皮苷、柚皮苷、没食子酸、绿原酸与沃柑的距离较近，表明这4种酚类物质在沃柑果皮中含量最高；与其他5个杂柑品种相比，橙类与芥子酸的距离较近，且含量显著高于杂柑，杂柑与芦丁的距离较近，含量显著高于橙类(表6)。

3 讨论

图3 果实酚类物质维度的偏好性分析
Fig.3 Preference analysis of phenols in fruits

不同柑橘品种果实中酚酸以咖啡酸和绿原酸为主，果肉中阿魏酸只在4个品种中检测出来，而另有研究发现柑橘中主要以咖啡酸和阿魏酸为主[20,22-23]，产生的差异可能与品种之间的差异、成熟度、产地等有关；类黄酮以芦丁和柚皮苷为主，该结果与李利改等[24]的研究结果基本一致；果肉中所测10种酚类的总量由高到低依次为：沃柑、塔罗科血橙、金诺、奈维林娜脐橙、黄果柑、晚红血橙、口之津32号、春见。果皮中以口之津32号最高，其次依次为金诺、沃柑、春见、晚红血橙、黄果柑、奈维林娜脐橙、塔罗科血橙；不同柑橘品种果肉中的酚类物质含量低于果皮，果皮中芦丁含量是果肉的1.15～90.39倍，这与SCORDINO等[25]的研究结果基本一致。本研究的8个柑橘品种果皮和果肉中芦丁含量均在金诺中最高，且在8个柑橘品种果肉中，金诺阿魏酸、没食子酸和芦丁的含量最高；在8个柑橘品种果皮中，口之津32号咖啡酸、阿魏酸、对羟基苯甲酸的含量最高；新橙皮苷、柚皮苷、没食子酸和绿原酸在沃柑果皮中最多；橙类可能与芥子酸存在一定的关系，即芥子酸可能在橙类中的含量较高，同时杂柑中芦丁含量显著高于橙类，因此杂柑可能与芦丁有一定的关系，即芦丁在杂柑中的含量较高。目前，对杂柑和橙类分类研究的相关报道还较少，今后可继续对杂柑和橙类中其他酚类物质以及不同品种进行研究，分析其规律，对探讨不同柑橘品种果实间酚类物质含量的差异以及提高果实的综合利用价值具有重要意义。

本研究用高效液相色谱法对柑橘进行测定时的优点有：样品提取方法简单，无需繁琐的提取步骤，如较多研究报道，样品预处理需要振荡提取[19-20]或者旋转蒸干[20,26]，本方法能更快速简便地对样品进行有效提取，但提取后还有其他酚类物质有待进一步确定其成分；已有研究报道，在脐橙果肉和果皮中均未检测到柚皮苷、新橙皮苷、柚皮素3种黄烷酮类酚类物质[19]，而本试验检测限低于0.03 μg/g，能在果肉和果皮中检测到这3种黄烷酮。同时本方法重复性好，精密度高，加样回收率高，因此能有效检测柑橘中的酚类物质。