燕麦发酵过程中微生物、理化指标及活性成分变化规律

史晓萌，陈建国*，梁寒峭，程池，赵众炜，祁永和，王定邦，梁世才

1(中国食品发酵工业研究院，中国工业微生物菌种保藏管理中心，北京，100015) 2(甘肃省定西市安定区政府，甘肃 定西，743000)3(甘肃伊麦坊科技股份有限公司，甘肃 定西，743000)

燕麦属于禾本科草本植物，包括皮燕麦和裸燕麦(莜麦)。燕麦作为一种全价营养谷物，可满足当代居民对膳食的更高追求——“营养与健康”[1-3]。

甜醅以燕麦或青稞为原料，经甜酒曲发酵而成，色泽黄润，醅粒如果肉，醅汁似糖水，深受甘肃、青海、内蒙古等西北地区人们的喜爱，但我国甜醅工业化生产尚属空白。本文利用甜酒曲纯种固态发酵燕麦，研究了发酵过程中微生物、理化指标及活性成分的变化规律，为工业化生产燕麦甜醅奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

燕麦：甘肃伊麦坊科技股份有限公司提供；甜酒曲：安琪酵母股份有限公司；β-葡聚糖测定试剂盒(双酶法)：爱尔兰Megazyme公司；芦丁标准品：中国食品药品检定研究院；没食子酸标准品：百灵威科技有限公司；Folin-Ciocalteu试剂：美国Sigma；葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、无水乙醇、NaOH、浓HCl、CuSO4、酒石酸钾钠等为分析纯。

1.2 仪器与设备

高速冷冻离心机(Avanti J-25),美国Beckman公司；pH计(FE20),梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；恒温培养箱(DHP-9160),上海一恒科学仪器有限公司；高效液相色谱仪(LC-20AD型,SPD-M20A二极管阵列检测器，RID-10A示差检测器),日本岛津公司；电泳仪(Mini-Protean型),美国Bio-Rad公司；凝胶成像分析系统(UVP GDS-8000型),美国UVP公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

精选燕麦→清洗→浸泡→蒸煮→冷却→接种→装于容器→发酵→甜醅样品[4-5]

燕麦经清洗后，先浸泡2 h，再蒸煮1.0 h，冷却至室温，加曲2.75 g/kg，于28 ℃分别发酵0、12、24、36、48、60和72 h。

1.3.2 米根霉和酵母计数[6]

1.3.3 理化指标测定

将燕麦甜醅样品混匀后，取200 g甜醅，加入100 mL蒸馏水(煮沸并冷却至室温)，置于组织捣碎机中粉碎，混匀后置于密闭玻璃容器中。

淀粉酶活力测定[7-8]：采用DNS比色法测定淀粉酶活力。酶活力定义：以1 mL酶液在pH 5.5、40 ℃的条件下，1 h水解1.0%淀粉液生成1 μmol葡萄糖为1个酶活力单位(U)。甜醅样品中淀粉酶活力以U/100 mg表示。

总酸含量测定[9]：滴定法。

pH值测定：pH计。

还原糖含量测定[10]：直接滴定法。

1.3.4 还原糖组成分析

色谱柱：Rezex RoA Organic Acid色谱柱(300 mm×7.8 mm，8 mm)，流动相：5 mmol/L H2SO4溶液，流速为0.6 mL/min，柱温80 ℃，进样量10 μL，检测波长210 nm。

1.3.5 蛋白质水解情况检测

SDS-PAGE法[5]。

1.3.6 活性成分测定

β-葡聚糖含量测定[11]：采用β-葡聚糖测定试剂盒(双酶法)。

总黄酮含量测定[12]：NaNO2-Al(NO3)3比色法。

总多酚含量测定[13]:Folin-Ciocalteu比色法。

总皂苷含量测定[14]:香草醛-高氯酸比色法。

1.4 数据分析

采用SPSS 19.0软件进行统计分析，数据结果以“平均值±标准差”(n=3)表示，Duncan法进行显著性分析，p<0.05为显著性差异。

2 结果与分析

2.1 霉酵菌数、淀粉酶活力及感官评分变化

如图1所示，0～24 h，米根霉和酵母生长较为缓慢，米根霉分泌淀粉酶量较少，糖化发酵不充分，还原糖含量较低，入口甜味过淡，香味不明显；24～48 h，随着米根霉的繁殖，淀粉酶分泌量加大，燕麦淀粉被充分转化为微生物可利用的还原糖，米根霉和酵母菌开始快速繁殖，淀粉酶糖化更充分，且产生更多的风味物质；48 h时，米根霉数量最高，达到1.35×104CFU/g，淀粉酶活力均达到峰值(78.83 U/100 mg)，此时，甜醅入口甘甜，香味纯正，颗粒饱满，感官评分最高；48～72 h，米根霉菌数开始衰减，积累的还原糖因大量被酵母利用而明显下降，酵母菌数峰值达1.26×106CFU/g，且发酵后期燕麦粒饱满性变差，开始出现黑色孢子斑点，感官评分逐渐下降。

2.2 还原糖、氨基酸态氮、总酸和pH值变化

图1 燕麦甜醅发酵过程中霉菌-酵母菌数，淀粉酶活力及感官评分的变化
Fig.1 Changes of microbial, amylase activity and sensory score in sweet fermented naked oat during fermentation

由图2-A可知，在12～60 h内，甜酒曲中米根霉分泌大量糖化酶，还原糖含量明显增加，最大值可达220.3 g/kg，较高的还原糖含量不仅增加了燕麦甜醅的甘甜口感，而且可以延长甜醅的贮藏时间[15]。与还原糖变化趋势类似，氨基酸态氮含量先升高后降低。

图2 燕麦甜醅发酵过程中还原糖、氨基酸态氮、总酸和pH值的变化
Fig.2 Changes of reducing sugar, amino nitrogen, total acid and pH in sweet fermented naked oat during fermentation

在0～24 h时，氨基酸态氮含量明显升高，48 h时达到最大值352.0 mg/kg，随后缓慢降低。燕麦甜醅发酵过程中，微生物利用蛋白酶系高效地降解燕麦蛋白，不仅分解成自身生长所需的小分子氮源，而且增加了甜醅产品中游离氨基酸含量，从而丰富了甜醅的风味和提高了人体对燕麦蛋白的利用率[16]。如图2-B所示，燕麦初始pH值为6.32，随着发酵时间延长，发酵产物pH值明显下降，最低达pH值4.73。12～36 h燕麦甜醅发酵产生的总酸含量随发酵时间延长总酸含量显著上升，最高达4.84 g/kg，之后缓慢下降。燕麦甜醅发酵过程中pH值、总酸的变化，与米根霉分解燕麦淀粉产生大量有机酸密切相关[17]。

2.3 还原糖组成变化

燕麦发酵过程中米根霉代谢产生糖化酶，将燕麦淀粉水解成大量还原糖，既为发酵过程中微生物生长代谢提供碳源，又保证了燕麦甜醅口感的甘甜。如图3所示，发酵0 h时，燕麦原料中只含有3.1 g/kg葡萄糖，随着发酵时间的延长，甜醅样品中逐渐产生了3种还原糖，以葡萄糖为主，其次为麦芽糖，麦芽三糖最少。12～48 h，葡萄糖含量呈现快速上升趋势，48 h达到峰值，含量为157.2 g/kg，随后有所减少。而麦芽糖和麦芽三糖含量随发酵时间逐步升高，72 h时二者含量分别为32.7 g/kg和15.0 g/kg。

图3 燕麦甜醅发酵过程中还原糖组成的变化
Fig.3 Changes of reducing sugar composition in sweet fermented naked oat during fermentation

2.4 蛋白质水解情况

如图4所示，发酵0 h时，燕麦蛋白在37 kDa处有明显的条带a，随着发酵时间的延长，燕麦蛋白条带a逐渐被水解，0～48 h降解明显，到48 h时，燕麦蛋白条带a被完全降解。从24 h开始，在30 kDa处出现燕麦蛋白条带b，条带b处的蛋白含量在24～48 h快速增加，之后逐渐减少。结果表明,在燕麦甜醅发酵过程中，大分子燕麦蛋白在微生物蛋白酶作用下逐渐被降解，小分子蛋白逐渐增多[5]。

图4 燕麦甜醅发酵过程中蛋白的SDS-PAGE图
Fig.4 SDS-PAGE patterns of proteins in sweet fermented naked oat during fermentation

2.5 活性成分的变化

图5所示为燕麦发酵过程中黄酮、皂苷、多酚和β-葡聚糖的变化规律。燕麦β-葡聚糖和总皂苷含量分别为20.5 g/kg和323.9 mg/kg，随着发酵时间的延长，β-葡聚糖和总皂苷含量无明显变化。燕麦初始多酚含量为233.6 mg/kg，多酚含量随发酵时间呈现上升趋势，36 h后趋于稳定，60 h多酚含量最高达505.2 mg/kg。而黄酮含量有所减少，由最初251.6 mg/kg降至179.0 mg/kg。

图5 燕麦甜醅发酵过程中活性成分的变化
Fig.5 Changes of active components in sweet fermented naked oat during fermentation
注：小写字母不同表示有显著差异(p<0.05)

3 结论

本文利用甜酒曲纯种固态发酵燕麦，解析了燕麦甜醅固态发酵过程中微生物、理化指标及活性成分的变化规律。米根霉在发酵初期(0～24 h)代谢产生糖化酶，将燕麦淀粉转化成大量还原糖和氨基酸态氮，为后期发酵提供了充足的碳源和氮源；24～48 h为发酵中期，总酸显著升高，pH值明显降低，有利于抑制杂菌的滋生，同时米根霉和酵母菌开始快速增殖，淀粉酶活力显著升高，产生大量葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖以及丰富的风味物质，赋予甜醅甘甜的口感和纯正的发酵麦香，感官评分达到最大值96.50分，为工业化生产燕麦甜醅过程中发酵终点的确定提供了科学依据；48～72 h为发酵后期，各项理化指标趋于稳定，无显著变化，但燕麦颗粒饱满性变差，出现了黑色孢子斑点，降低了感官评分。整个发酵过程中，燕麦甜醅中β-葡聚糖和总皂苷含量无明显变化，黄酮含量由251.2 mg/kg减少至179.0 mg/kg，而多酚含量随发酵时间呈现上升趋势，由最初233.6 mg/kg升至505.2 mg/kg。通过SDS-PAGE分析，在0～48 h大分子燕麦蛋白被明显水解，而小分子蛋白在24～48 h明显增加。

综上，控制燕麦发酵条件对甜醅产品的质量具有重要意义。本试验通过对燕麦甜醅固态发酵过程中霉酵数量、淀粉酶活力、还原糖、总酸及β-葡聚糖、总皂苷、多酚等指标的检测分析，为判断甜醅发酵终点和控制发酵过程提供了技术参数，为燕麦甜醅的工业化生产奠定了基础。