热应激对小鼠早期囊胚线粒体超微结构的影响

屈平平，李 涛，胡士林，田文儒

(1.山东畜牧兽医职业学院，山东 潍坊 261061； 2.青岛农业大学，山东 青岛 266109)

目前，热应激抑制早期胚胎发育的作用机理还不是很清楚。研究表明这可能是由以下两方面引起的，一方面热应激本身作为细胞损伤因子对细胞产生直接的细胞毒效应，如破坏DNA分子的完整性[1,2]、改变蛋白质图谱[3,4]、促进自由基的产生[4]、干扰细胞有丝分裂[5]、诱导细胞凋亡[6]等；另一方面胚胎抵抗热应激的防御系统不够完善，如缺乏抵抗氧化应激、保护蛋白质正确组装及降解变性蛋白的能力、不能有效的抵抗或修复热应激对胚胎的损伤。正常的细胞器结构是细胞器发挥生理功能的基础和保证。因此，通过透射电子显微镜观察热应激后胚胎线粒体超微结构的变化，为判断热应激对胚胎发育能力的影响提供更为准确的依据，并为探索热应激抑制哺乳动物早期胚胎发育的作用机理提供依据。

1 试验材料

1.1 试验动物

试验动物为8～9周龄性成熟昆明种(KM)小鼠，体重25±5 g，购于山东大学实验动物中心。饲喂实验动物标准饲料(购于康大饲料有限公司)，自由饮水，并进行光照控制(6:00～18:00光照，18:00～6:00黑暗)；温度控制在18～25℃。适应饲养一周后，用于超数排卵。

1.2 试验药品

NaCl、KCl、NaHCO3、KH2PO4、MgSO4、CaCl2、EDTA、HEPES、BSA、谷氨酰胺、乳酸钠、丙酮酸钠、青霉素、硫酸链霉素、琼脂糖等均购自Sigma公司；PMSG和hCG购自宁波三生药业；25%戊二醛、锇酸(0.5 g包装)、Epon-812树脂包埋试剂盒均购自SPI公司；30%、50%、70%、80%、90%、100%丙酮；0.01 mol/L PBS等。

1.3 试验器材

体视显微镜(SZX-12，日本OLYMPUS公司)；

超纯水系统(Synyhes，法国Milli-Q公司)；

CO2培养箱(Galaxy B，德国 MMM 公司)；

透明加热板(PW-1，日本富士平公司)；

超薄切片机(LKB-V，瑞典)；

透射电子显微镜(JEM-1200EX，日本)。

2 试验方法

2.1 小鼠胚胎体外培养

2.1.1 小鼠超数排卵 将雌性小鼠于16:00腹腔内注射PMSG(10IU/只)，48 h后腹腔注射hCG(10IU/只)，雌鼠注射hCG后立即与成熟雄鼠1:1合笼。所用雄鼠必须是至少在5d内没交配过的健康雄鼠。次日8:00检查阴道栓，有阴栓者备用

2.1.2 CZB培养液的配制 试验以CZB系列培养液进行小鼠胚胎体外培养。CZB系列培养液的配方见附录7。Hepes-CZB用来冲胚和清洗胚胎。透明质酸酶溶液的配制是在Hepes-CZB配方中不添加牛血清白蛋白(Bovine Aerum Albumin，BSA)的基础上，按照0.1～0.3 mg/mL添加透明质酸酶，用来除去受精卵周围的卵丘细胞。胚胎培养液分为CZB和葡萄糖-CZB(G-CZB)两种。G-CZB是在CZB培养液中添加1 mg/mL葡萄糖配制而成。4-细胞期前胚胎在CZB培养液培养，以免引起2-细胞期胚胎发育阻滞。4-细胞期以后的胚胎在G-CZB培养液中培养。

2.1.3 小鼠原核胚收集及体外培养 在检出阴栓当天19:00左右，用脱臼法处死雌鼠，取出输卵管和部分子宫角，在体视显微镜下，用1 mL注射器针头将输卵管壶腹部撕破，原核期胚胎连同颗粒细胞一起逸出。再将细胞团转移至透明质酸酶中，反复吹打，去除原核胚周围的颗粒细胞。将形态完好的原核胚在Hepes-CZB中冲洗5次后，转移至50μL预平衡6～12 h的CZB培养液微滴中，每个液滴放置30枚胚胎，置于37℃、5%CO2、100%RH的CO2培养箱中进行培养。当胚胎发育至4-细胞期时，将胚胎转移至G-CZB培养液中继续培养至早期囊胚，用于后续试验。

2.1.4 小鼠囊胚分期 根据囊胚的扩张和孵出程度将囊胚分成1～6级:

1级：早期囊胚(Early blastocysts)，囊胚腔体积小于囊胚总体积的一半；

2级：囊胚(Blastocysts)，囊胚腔体积大于囊胚总体积的一半；

3级：完全扩张囊胚(Full blastocysts)，囊胚腔占据整个囊胚；

4级：扩张后囊胚(Expanded blastocysts)，囊胚腔体积较早期囊胚明显扩大，透明带变薄；

5级：正在孵化的囊胚(Hatching blastocysts)，囊胚正在从透明带破裂口孵出；

6级：孵化出的囊胚(Hatched blastocysts)，囊胚完全从透明带中脱出。

2.2 热应激处理

将小鼠早期囊胚分别处以39℃、5.5%CO2和41℃、6%CO2热应激处理2 h。分别于热应激结束后立即收集胚胎和经37℃、5%CO2恢复2 h时收集胚胎，制备透射电镜样品。对照组小鼠早期囊胚在37℃、5%CO2下培养。胚胎处理同热应激组。

2.3 制备透射电镜样品药品配制

2.3.1 0.2mol/L pH7.4磷酸缓冲液(PB) 称取53.65 g磷酸氢二钠(Na2HPO4·7H2O)，溶解于双蒸水，然后定容至1 000 mL，配制成0.2 mol/L 磷酸氢二钠贮备液(A液)。再称取27.60 g磷酸二氢钠(NaH2PO4·H2O)，溶解于双蒸水，然后定容至1 000 mL，配制成0.2 mol/L 磷酸二氢钠贮备液(B液)。分别量取40.5 mL A液和9.5 mL B液，充分混和后即得到0.2 mol/L pH7.4 PB。

2.3.2 0.01 mol/L pH7.4磷酸盐缓冲生理盐水(PBS) 称取8.5～9 g NaCl，溶解于50 mL 0.2 mol/L PB中，然后加重蒸水，定容至1 000 mL。充分摇匀即可得到0.01 mol/L pH7.4 PBS。

2.3.3 2.5%戊二醛 量取10 mL 25%戊二醛溶液与50 m; 0.2 M PB(pH7.4)充分混和，然后再加蒸馏水定容至100 mL，即得到2.5%戊二醛固定液。

2.3.4 1%OsO4先用自来水洗去OsO4安瓿瓶上的标签，再用浓洗液浸泡4～8 h，用自来水清洗后再用蒸馏水清洗，然后用砂轮在安瓿瓶上划痕，洗净后再放入瓶中，盖好瓶塞，用力撞击安瓿，或者用清洁的玻璃棒敲碎安瓿。待其破后用25 mL重蒸水稀释。将原液瓶封密，用黑纸包好于通风橱或者冰箱中待其完全溶解，即为2%OsO4储存液。在通风橱中，取5 mL 2%OsO4储存液和5 mL 0.2mol/L PB( pH7.4)，充分混和后，用黑纸包好于4℃冰箱中保存。

2.3.5 Epon-812包埋剂 先量取10 mL Epon-812，在磁力搅拌的搅拌下，缓慢加入16 mL DDSA，待充分混匀，得到A液；再量取10 mL Epon-812，在磁力搅拌的搅拌下，缓慢加入8.9 mL MNA，待充分混匀，得到B液；A液和B液按比例混合，(冬天1:4；夏天1:9)，待上述二液混匀后再按1.5%～2%的体积比，在充分搅拌中滴加DNP-30。

2.3.6 硼砂甲苯胺蓝染液 称取1 g硼砂(四硼酸钠)，用100 mL双蒸水加热溶解，再加入1 g甲苯胺蓝，待全部溶解过滤，滤液即为甲苯胺蓝染色液。

2.3.7 醋酸铀染色液(饱和液) 称取2 g醋酸铀，溶解于100 mL 50%～70%乙醇，即得到pH4.2的醋酸铀饱和液。

2.3.8 柠檬酸铅染色液 分别称取1.33 g硝酸铅和1.76 g柠檬酸钠，再加入30 mL双蒸水，用力振荡30 min，待化学反应生成柠檬酸铅，溶液呈现为乳白色的柠檬酸铅混悬液，然后加入1 N氢氧化钠8 mL，使柠檬酸铅溶解，变成无色透明状，最后再加双蒸水至50 mL，此时溶液的pH为12。

2.3.9 2%琼脂 称取1 g琼脂溶于50 mL的0.01 mol/L pH7.4的PBS中，加热溶解，高压灭菌，冷却后储存于4℃备用。

2.4 胚胎超薄切片制备

2.4.1 前固定 将预冷的2.5%戊二醛，在3.5 cm的塑料培养皿中作2个100μL的小液滴。在体视镜下，用吸胚针将胚胎从培养液中转移到固定液中，每个液滴中放置50枚胚胎。待固定10 min后再将胚胎在转移到新鲜的固定液中，放4℃冰箱中再固定2 h。

2.4.2 清洗 同样在3.5 cm的塑料培养皿中作3个100 μL的0.01 mol/L PBS小液滴，于体视镜下，用吸胚针将胚胎从固定液中转移至0.01 mol/L PBS中，室温下清洗三次，每次10～15 min。

2.4.3 后固定 同样做2个50～100 μL的1%锇酸小液滴，将胚胎转移到其中，室温避光固定1.5 h。

2.4.4 清洗 同样在3.5 cm的塑料培养皿中作3个100 μL的0.01 mol/L PBS小液滴，于体视镜下，利用吸胚针将胚胎从固定液中转移至0.01 mol/L PBS中，室温下清洗三次，每次10～15 min。

2.4.5 琼脂糖预包埋 将清洗好的胚胎用吸胚针小心的转移到PCR反应管，再加50 μL的PBS，2 000 r/min离心1～2 min。用小量程移液器小心吸弃PBS，慢慢加入100 μL 40℃左右的2%的琼脂糖溶液，立即以2 000 r/min离心1～2 min。待琼脂糖凝固后用牙签将胚胎团取出，然后切割成1～2 mm3的小琼脂糖块。

2.4.6 脱水 将琼脂糖块在青霉素小瓶中按照以下程序进行脱水：先用30%丙酮4℃脱水15 min，再用50%丙酮4℃脱水15 min，然后在70%丙酮中4℃过夜；次日在80%丙酮中室温脱水15 min，90%丙酮室温脱水10 min，再经100%丙酮室温脱水2次，每次10 min。

2.4.7 渗透 将琼脂糖块先在Epon-812包埋剂与丙酮1:2(V/V)混和液中室温渗透2 h，再在Epon-812包埋剂与丙酮2:1(V/V)混和液中室温渗透4～6 h，然后在37℃干燥箱中，纯Epon-812包埋剂中渗透4～6 h。浸透过程均在干燥器中进行。

2.4.8 包埋 将Epon-812倒入平板包埋板中，用牙签将琼脂糖块放入包埋剂中，37℃过夜，于次日早晨将琼脂糖块位置摆正。

2.4.9 聚合 将干燥箱调至45℃，聚合12 h, 然后在60℃聚合24 h～36 h。聚合完毕，关闭温箱。待自然冷却后，取出包埋块，保存于干燥器中。

2.4.10 半薄切片和染色 用单面刀片修整聚合良好的胚胎团顶端，直至胚胎团表面成梯形，四边修整成约45℃斜面，整个包埋块类似于一个平顶的塔形。用超薄切片机切出0.5μm的切片，用捞片镊捞起切片，放在载玻片上，玻片置于酒精灯上加热烘干(时间大约为1 min)。然后滴1滴1%甲苯胺蓝染色液，继续烘烤数秒钟后冷却1～2 min，再用自来水将玻片表面染液冲洗彻底后，滤纸吸干水分，自然干燥，光镜下观察，定位于形态完好的囊胚上。

2.4.11 超薄切片及染色 根据半薄切片提示，将胚胎团顶端平面修整为长2 mm、宽1 mm的长方形，用超薄切片机切出50～100 nm超薄切片，再用直径3 mm、200目铜网捞起，滤纸吸干后用蜡盘进行醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色，蒸馏水冲洗后在透射电子显微镜下观察。

2.5 图片处理

所有图片采用Adobe Photoshop 7.0 软件处理。

3 结果

在37℃、5%CO2条件下正常培养的小鼠早期囊胚细胞中，可见到大量的线粒体分布于胞质中，围绕细胞核排列(见图A)。大部分线粒体为呈圆形或帽状的不成熟线粒体，线粒体基质密度较大，在线粒体的边缘具有不发达的弓形嵴；少数线粒体为椭圆形或棒状的成熟线粒体，具发达的横嵴，基质较浅；还有一些线粒体为不成熟线粒体状态和成熟线粒体的过渡态，线粒体开始变大，拉长，并有横嵴出现。39℃热应激组小鼠早期囊胚细胞内线粒体发生轻微肿胀，还有少量线粒体发生空泡化(见图B、C)；热应激结束后胚胎经37℃再培养2 h，肿胀的线粒体能够恢复到正常。41℃热应激组小鼠早期囊胚细胞内线粒体的数目减少，线粒体严重变形和肿胀(见图D)；肿胀的线粒体变大变圆，基质变浅呈透明形态、嵴变短变少甚至消失(见图E)；有的线粒体嵴排列紊乱不清晰见图F)。热应激结束后胚胎经37℃再培养2 h，线粒体变形和肿胀现象没有得到缓解。

图A-F 不同强度热应激后小鼠早期囊胚线粒体的形态变化注：A：37℃正常培养组胚胎；B-C：39℃热应激组胚胎；D-F：41℃热应激组。其中：M为线粒体，SM为肿胀线粒体，N为细胞核，Nu为核仁，Ly为溶酶体，RER为粗面内质网，LD为脂滴。

4 讨论

热应激诱导细胞超微结构改变而导致胚胎发育阻滞的机制还不清楚。当其他细胞遭受热应激时，会发生线粒体肿胀、畸形、活力低下、膜电位降低[7-9]、骨架重排[10,11,12]、蛋白质集聚[13]、细胞器重排或崩解[14]、膜结构和通透性变化[15,16]等变化。热应激所导致的各种细胞器形态、数量、位置的变化，既是热应激损伤胚胎细胞器的一种表现，也是胚胎对抗热应激的一种保护性反应。热应激损伤和胚胎自我保护之间的相互对抗决定着细胞的存亡。

线粒体是对细胞内外环境应激最为敏感的细胞器之一。在热应激刺激下，线粒体内膜上PTP开启，由于线粒体基质内的高渗透压，细胞内容物无选择性内流，以致线粒体基质发生肿胀。PTP的开启还会导致线粒体内外H+梯度消失，呼吸链脱偶联，ATP合成受阻，能量供应不足。另外，线粒体上PTP孔道开放，使膜间隙中与凋亡相关的活性物质，如细胞色素C、AIF、Smac/DIABLO等释放，诱导细胞凋亡[17-19]。在本研究中， 39℃ 2 h热应激仅导致小鼠早期囊胚的线粒体轻微肿胀和少数线粒体发生空泡化，热应激后胚胎在37℃再培养2 h后，线粒体形态基本上恢复到正常。而41℃ 2 h热应激导致小鼠早期囊胚的线粒体严重变形，高度肿胀；损伤的线粒体被溶酶体吞噬、消化，最后在溶酶体中形成嗜锇小体或髓样小体。热应激胚胎经37℃再培养2 h后，线粒体异常仍旧非常严重。说明41℃热应激2 h对线粒体损伤程度远远超过了线粒体的自我修复能力，这可能是41℃热应激2 h导致小鼠早期囊胚后续发育力下降的主要原因之一。

参考文献:

[1] Yin Y, Hawkins KL, DeWolf WC, et al. Heat Stress Causes Testicular Germ Cell Apoptosis in Adult Mice[J]. Journal of Andrology, 1997, 18 (2 ): 159-165.

[2] Banks S, King SA, Irvine DS, et al.Impact of a mild scrotal heat stress on DNA integrity in murine spermatozoa[J]. Reproduction, 2005, 129(4): 505-514.

[3] Edwards JL, Hansen PJ. Elevated temperature increases heat shock protein 70 synthesis in bovine two-cell embryos and compromises function of maturing oocytes[J]. Biology of Reproduction, 1996, 55(2): 340-346.

[4] Zhu B, Maddocks S. The effect of paternal heat stress on protein profiles of pre-implantation embryos in the mouse[J]. International Journal of Andrology, 2005, 28(3): 128-136.

[5] Hut HM, Hampinqa HH, Sibon CM. Hsp70 Protects Mitotic Cells against Heat-induced.Centrosome Damage and Division Abnormalities[J]. Molecular Biology of the Cell.Vol, 2005, 16(8): 3776-3785.

[6] Paula-Lopes FF, Hansen PJ. Heat-shock induced apoptosis in bovine pre-implantation embryos is a developmentally-regulated phenomenon[J]. Biol Reprod, 2002, 66(4): 1169-1177.

[7] Gannes FM, Leducq N, Diolez P, et al. Mitochondrial impairment and recovery after heat shock treatment in a human microglial cell line[J]. Neurochem Int, 2000, 36(3): 233-241.

[8] Dimopoulou K, Thomopoulos GN. Ultrastructural studies on the effect of heat shock treatment on larval salivary gland cells of Drosophila auraria[J]. J Submicrosc Cytol Pathol, 2000,32(4): 573-584.

[9] Kim WK, Mirkes PE. Alterations in mitochondrial morphology are associated with hyperthermia -induced apoptosis in early postimplantation mouse embryos[J]. Birth Defects Res And Clin Mol Teratol, 2003, 67(11): 929-40.

[10] Shyy TT, Asch BB, Asch HL. Concurrent collapse of keratin filaments, aggregation of organelles, and inhibition of protein synthesis during heat shock response in mammary epithelial cells[J]. J Cell Biol, 1989, 108(3): 997-1008.

[11] Coss RA, Alden ME, Phyllis R, et al. Response of the microtubular cytoskeleton following hyperthermia as a prognostic indicator of survival of Chinese hamster ovary cells[J]. Int J Rad Oncology Biol Phys, 1996, 34(2): 403-410.

[12] Welch WJ, Suhuan JP. Morphological study of the mammalian stress response: characterization of changes in cytoplasmic organelles, cytoskeleton, and nucleoli, and appearance of intranuclear actin filaments in rat fibroblasts after heat-shock treatment[J]. J Cell Biol, 1985, 101(4): 1198-1211.

[13] Wachsberger PR, Coss RA. Alterations in nuclear matrix ultrastructure of G1 mammalian cells following heat shock: resinless section electron microscopy, biochemical, and immunofluorescence studies[J]. J Cell Physiol,1993, 155(3): 615-34.

[14] Rivera RM, Kelley KL, Erdos GW, et al. Alterations in ultrastructural morphology of two-cell bovine embryos produced in vitro and in vivo following a physiologically-relevant heat shock[J]. Biol Reprod, 2003, 69(6): 2068-2077.

[15] Coakley WT. Hyperthermia effects on the cytoskeleton and on cell morphology[J]. Symp Soc Exp Biol, 1987, 41: 187-211.

[16] Lepock JR. Involvement of membranes in cellular responses to hyperthermia[J]. Radiat Res, 1982, 92(3): 433-438.

[17] Mirkes PE, Little SA. Cytochrome C release from mitochondria of early postimplantation murine embryos exposed to 4-hydroperoxycyclophosphamide, heat shock, and staurosporine[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2000, 162(3): 197-206.

[18] Susin SA, Zamzami N, Kroemer G. Mitochondria as regulators of apoptosis: doubt no more[J]. Biochim Biophys Acta, 1998, 1366(1-2): 151-165.

[19] Padmanabhan R, Tariq S, Musaed N. Mitochondrial dysmorphology in the neuroepithelium of rat embryos following a single dose of maternal hyperthermia during gestation[J]. Exp Brain Res, 2006, 173(2): 298-308.