高效液相色谱法测定面粉中过氧化苯甲酰的含量

张 曼，刘箫音

（赤峰学院 化学化工学院，内蒙古 赤峰 024000）

1 前言

1.1 过氧化苯甲酰

过氧化苯甲酰，简称BPO或BP，白色粉末，无色，稍有些苦杏仁味，难溶于水，易溶于有机溶剂.因为过氧化苯甲酰具有强氧化作用，能够被还原性物质还原成苯甲酸.苯甲酸能够杀死面粉中的一些微生物，具有杀菌以及防霉作用.这种特质有益于面粉的长时间保存和贮藏.

1.2 过氧化苯甲酰与面粉

由于过氧化苯甲酰能够有效地抑制面粉中微生物的繁殖成长，故过氧化苯甲酰具有提高面粉弹性，提升面粉等级的作用，从而改进面粉的品质.它分解生成的苯甲酸能与小麦胚乳中的类胡萝卜素迅速反应，从而使面粉达到脱色、漂白的效果，所以面粉厂家通常将其作为面粉添加剂的首选.

过氧化苯甲酰(BPO)，是面粉厂家备受青睐的一种改进剂，可以使面粉达到增白、和面粉的贮藏性能得以提高的效果[1].研究表明，过多的过氧化苯甲酰摄取到人体，短时间可使人呈现恶心、头晕、神经衰弱等中毒现象，长时间食用会对肝脏形成首要的危害.且过量添加会使其颜色发青，同时破坏面粉中的维生素，降低面筋质量，严重影响食品卫生指标和食用品质[2].因此，为了人们的身体健康，严格控制其添加量是十分必要的.各国都规定了使用限量.而我国的规定安全使用限量是0.06g/kg[3].按照标准，并出于安全及性能的考虑，人们对面粉中过氧化苯甲酰含量的测定越来越重视，测定的方式越来越多.

1.3 面粉中过氧化苯甲酰含量的测定方法

目前，测定过氧化苯甲酰的含量的方法主要有：高效液相法、气相色谱法、电化学法、分光光度法、化学发光法、荧光光度法等.[4]

1.3.1 气相色谱法

气相色谱法是还原性铁粉和盐酸与过氧化苯甲酰反应，该还原反应将过氧化苯甲酰还原后生成苯甲酸，经加入石油醚-乙醚有机混合溶液提取苯甲酸后，经气相色谱仪测定后，与做出的标准系列进行比较定量，从而通过计算，将苯甲酸的含量换算成为过氧化苯甲酰的含量[5].此法灵敏度高，但是操作耗时烦琐，对仪器设备条件要求高.

1.3.2 荧光光度法

裴翠锦[6]的方法是在中性或弱酸性溶液中，在氨存在下，苯胺和过氧化苯甲酰可以生成强荧光物质，而过氧化苯甲酰能够对这种强荧光物质产生抑制作用.根据图谱中呈现的过氧化苯甲酰对该种荧光物质的抑制作用的程度从而来确定被测物质中的过氧化苯甲酰含量的多少.但该方法对操作过程中各条件要求较为苛刻，不易于得到理想的精确结果.

1.3.3 分光光度法

由于过氧化苯甲酰具有强氧化性，能够使一些物质被氧化，利用这些物质自身带有显色反应或者与其他物质能够产生显色反应，经分光光度计测定，计算从而得出过氧化苯甲酰的含量.这种方法不需要提取和分离，操作简便快速.徐竞[7]利用过氧化苯甲酰与碘化钾反应后可以产生苯甲酸和碘，然后通过淀粉溶液的加入，能够使得溶液的颜色变蓝.过氧化苯甲酰的最大吸收波长在585nm处，且与过氧化苯甲酰浓度在指定的检测范围内能够呈现精准的线性关系.

1.3.4 化学发光法

Wada等人发现：在紫外光的照射下，过氧化苯甲酰可以转变为H2O2.并且根据过氧草酸酯发生的化学发光反应，创立了一种过氧化苯甲酰含量测定的新方法.但是该方法需要经过高效液相色谱来进行分离几种氧化物.过程比较烦琐，对设备要求也高.

1.3.5 电化学法

选用萃取剂-二氯甲烷，底液-二氯甲烷和乙酸按比例混合，支撑电解质-四丁基高氯酸铵；选用工作电极-玻璃电极，方法-视差脉冲安伏法来进行过氧化苯甲酰含量的测定.虽然此方法相对比较简单，然而，用到的氯仿以及二氯甲烷均疑可能为致癌物，而且氯仿在见光的情况下会逐步地分解成剧毒的氯化氢和光气，这两种物质对人体的危害相当的大.

1.3.6 高效液相法

气相色谱这种分析技术是在二十世纪五十年代出现的，这种高效分析技术包括分离和分析双重科技.1903年，首次提出色谱法和色谱图的是德国植物化学家茨维特.然而把化学键合固定相和高压泵融入液相色谱就形成了HPLC是在60年代的后期.1970年中期之后，液相色谱融入了微处理机的技术，它的融入进一步使仪器的分析精度和自动化水平得到擢升.

高效液相色谱是由“高压输液泵”“色谱柱”“进样器”“检测器”“馏分收集器”以及“数据获取”和“处理系统”等部分构成的.色谱法的一个重要延伸及运用就是高效液相，它的流动相为液体，并且输液系统采用高压程序，将具备不同比例的复杂溶剂和不同极性的简单溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，各组分在柱内被分离后，进入到检测器后进行检测，从而实现对试样的分析.试样进来检测器，用纪录仪纪录色谱图，根据色谱图上出现的物质成分的峰面积、峰高或峰宽对浓度作标准曲线而进行定量分析.

1.4 高效液相色谱法的原理及应用

高效液相色谱法测定过氧化苯甲酰含量的原理：被检测样品在通过有机溶剂的提取后，使过氧化苯甲酰经还原剂还原成为苯甲酸，然后经过高效液相色谱的测定，再与实验的标准系列（过氧化苯甲酰或苯甲酸）的结果来进行计算并定量.[8]这种方法具有高压、高效、高灵敏度，分析速度快等特点.该方法被延伸运用于医学和生物以及化学等各个先进的科研领域.

本论文涉及的操作全部过程：面粉中的过氧化苯甲酰先经甲醇溶解，后采用超声震荡的方式，以确保面粉中的过氧化苯甲酰经甲醇已经完全地分解为苯甲酸，最后再经过离心机的高效离心，取经过滤膜后的上清液，直接通过高效液相色谱检测器进行检测.记录各样品溶液的保留时间与峰面积的值.对比过氧化苯甲酰系列标准溶液做出的标准曲线，从而确定被测面粉中过氧化苯甲酰的含量.

2 实验部分

2.1 实验仪器

高效液相色谱仪：Agilent Technologies 1260 Infinity型；

电子天平：TP-214型（北京赛多利斯仪器系统公司）；

离心机；离心管；

超声波清洗器：SB25—12DT型（宁波新芝生物科技股份有限公司）；

0.45μm的过滤膜；

50mL容量瓶六个；100mL容量瓶一个；5mL吸量管一支；洗耳球一个；保鲜膜若干；称量纸.

2.2 实验药品

表1 实验药品规格表

实验面粉为内蒙古赤峰市红山区西南地村粮油店散装面粉；

实验中用水均为杭州娃哈哈集团生产的“娃哈哈”纯净水；所有溶剂和溶液在分析前都已经过0.45μm的过滤膜进行过滤.

2.3 标准溶液的配制

2.3.1 过氧化苯甲酰操作液的配制

10μg/mL的标准溶液：用电子天平准确称取0.1000g标准BPO于100mL容量瓶中，加入适量甲醇超声震荡1min，带固体全部溶解后，用甲醇定容到刻度，摇匀，定容.备用.

2.3.2 过氧化苯甲酰标准溶液的配制

配置不同浓度的过氧化苯甲酰的系列溶液：用移液管分别准确地移取上述10μg/mL的BPO标准溶液5mL、10mL、20mL、30mL、40mL、50mL 至 6 个 50mL 的容量瓶中，用甲醇定容，得到 1、2、4、6、8、10μg/mL 的标准系列溶液.分别标号为1～6号.各标准溶液浓度见如下表2.

表2 过氧化苯甲酰系列标准溶液的浓度

2.4 色谱条件的选择

2.4.1 检测波长的选择

在进样量为5μL，压强为280kpa，流速为2.0mL/min的色谱条件下，分别测定BPO在230nm、235nm、240nm各个波长处的峰面积.不同波长下溶液的色谱图如下图1～3所示，不同波长下溶液的定性分析数据如下表3～5所示.

图1 检测波长为230nm标准溶液的色谱图

表3 检测波长为230nm标准溶液的定性分析数据

图2 检测波长为235nm标准溶液的色谱图

表4 检测波长为235nm标准溶液的定性分析数据

图3 检测波长为240nm标准溶液的色谱图

表5 检测波长为240nm标准溶液的定性分析数据

2.4.2 流速的选择

在进样量为5μL，压强为280kpa，检测波长为235nm的色谱条件下，分别测定了BPO在1.0mL/min、1.5mL/min、2.0mL/min各个流速下的峰面积.不同流速下溶液的色谱图如下图4～6所示，不同波长下溶液的定性分析数据如下表6～8所示.

图4 流速为1.0mL/min标准溶液的色谱图

表6 流速为1.0mL/min标准溶液的定性分析数据

图5 流速为1.5mL/min标准溶液的色谱图

表7 流速为1.5mL/min标准溶液的定性分析数据

图6 流速为2.0mL/min标准溶液的色谱图

表7 流速为2.0mL/min标准溶液的定性分析数据

2.4.3 面粉样品溶液的配制

用电子天平准确称取面粉样品1.0000g于洁净的离心管中，准确加入10.00mL甲醇，用保鲜膜密封后，室温下超声震荡30min，然后放入离心机，在2000r/min的转速下离心15min.取上清液约5mL，用0.45μm的过滤膜过滤.

2.5 高效液相色谱的测定

2.5.1 高效液相色谱对过氧化苯甲酰标准溶液的测定

取1号到6号过氧化苯甲酰标准溶液，分别放入小样品瓶中，对应放入各样品瓶槽中，自动进样5μL进入高效液相色谱仪中，在上述选择高效液相色谱条件最佳情况下，对不同浓度的过氧化苯甲酰标准溶液进行测定，标准液图谱如下图7.

图7 过氧化苯甲酰标准液的高效液相色谱图

表8 标准曲线数据

2.5.2 高效液相色谱对面粉样品中过氧化苯甲酰的测定

将样品放入样品瓶中，放入样品槽，自动进样5μL进入高效液相色谱仪中，在上述选择高效液相色谱条件最佳情况下，对样品溶液进行测定，样品液图谱如下图8.

图8 面粉样品液的高效液相色谱图

表9 面粉样品液的定性分析数据

3 实验结果

3.1 标准曲线的绘制

根据实验的数据，对过氧化苯甲酰标准溶液绘制标准曲线，以过氧化苯甲酰标准溶液的浓度为横坐标，以高效液相色谱测定的过氧化苯甲酰标准溶液的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线如图9所示.

图9 过氧化苯甲酰标准液的标准曲线

3.2 面粉样品中过氧化苯甲酰的含量计算

样品中过氧化苯甲酰的质量=浓度*溶液体积

面粉中BPO含量=BPO的量/面粉的量

表10 面粉中BPO含量

通过以峰面积和浓度绘制标准曲线的定量分析，以及计算结果，可以得出：用高效液相色谱法测定面粉中过氧化苯甲酰的含量为0.01353g/kg，符合国家标准0.06g/kg，是食用者可选的健康面粉.并且，高效液相色谱法可以快速测出色谱图，该方法准确测定含量，对测试结果有较高的准确度，因此，高效液相色谱法的应用前景十分广泛.

参考文献：

〔1〕雷根虎,熊晓虎,霍艳敏.高效液相色谱法测定面粉中过氧化苯甲酰的含量[J].西北大学学报，2006,36（6）：911-914.

〔2〕戚丽,胡颖蕙,张正竹.高效液相色谱法测定面粉中过氧化苯甲酰的含量[J].安徽农业大学学报，2006,33(4)：560-562.

〔3〕宋悦,侯彩云.过氧化苯甲酰检测方法的试验研究[J].中国粮油学报,2005,20(5)：124-126.

〔4〕周冬芝,赵静.面粉中过氧化苯甲酰检测方法比较分析[J].农产品加工,2012（9）：136-138.

〔5〕侯彩云,石文贞,王启辉.小麦粉中过氧化苯甲酰含量定性检测方法的研究[J].粮油食品科技,200816（1）：53-54.

〔6〕裴翠锦,姚国光,张稳蝉.面粉中过氧化苯甲酰含量的测定[J].安徽农业科学.2010,38(24)：13384-13385.