白藜芦醇抑制人结肠癌细胞增殖与骨形态发生蛋白7的关系研究

朱茄慧，曾于桦，王 涵，廖云鹏，马 妍，吴 柯，何百成

(1.重庆市生物化学与分子药理学重点实验室，2.重庆医科大学药理学教研室，重庆 400016)

结肠癌是常见的消化道肿瘤，每年约有120万新发病例和60万死亡病例[1]。现阶段，对结肠癌的治疗方式包括手术、放射治疗和化疗。虽然已引入靶向药物治疗结肠癌，如贝伐单抗、西妥昔单抗、帕尼单抗等，但预后仍不能令人满意[2]。因此，临床仍急需研发能治疗结肠癌且高效低毒的药物。传统中药或中药有效单体衍生物是治疗癌症的有效药物来源之一，如喜树碱、长春新碱、紫杉醇等[3]。白藜芦醇(resveratrol，Res)是天然多酚类化合物，又称芪三酚。研究表明，Res可以抑制胰腺癌、乳腺癌、结肠癌等多种癌细胞增殖及促凋亡[4]。对于结肠癌，尽管Res的抗癌作用已得到验证[5]，但该作用的具体分子机制尚不十分清楚。

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)是转化生长因子TGF-β超家族的一个亚族，在调控胚胎发育的多个关键步骤，以及各种细胞的生长、分化和凋亡调节中起重要作用。目前，已经确定约20个BMP亚族成员[6]。据报道，BMP可能与癌症发生发展有关，如BMP9可在肝癌细胞中促进增殖和抗凋亡[7]，BMP2在卵巢癌细胞中促进增殖[8]。同时，也有研究表明，BMP信号在肿瘤中也具有相反的作用，如BMP7能抑制胃癌、肾癌、乳腺癌、结肠癌细胞增殖[9]。BMPs不仅可以通过经典的BMP/Smad途径传递信号，还可通过非经典的BMP/Smad途径发挥功能，如PI3K/Akt信号。PI3K/Akt信号已被发现在多种癌症中过度激活，而PTEN作为一种抑癌基因，可负性调节PI3K/Akt信号的转导活性[10]。本研究主要对Res抑制HCT116细胞增殖作用与BMP7的关系进行分析，并初步探讨BMP7发挥该作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株 HCT116细胞系购自American Type Culture Collection(ATCC)，细胞培养条件为5% CO2及37 ℃，培养基为含10% FBS的DMEM(100 kU·L-1青霉素及0.1 g·L-1链霉素)。

1.1.2试剂 Res购于西安昊轩生物科技有限公司；本实验所用一抗均购自Santa Cruz Biotechnology公司；HRP标记二抗购于碧云天生物技术公司；Annexin V-EGFP试剂盒购于南京凯基生物科技有限公司；CCK-8试剂盒购于上海七海复泰生物科技有限公司；PCR试剂盒购于TaKaRa公司。

1.1.3仪器 细胞培养箱(美国Thermo公司)，倒置荧光显微镜(日本Nikon公司)，定量PCR仪及凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)，脱色摇床(上海世平实验仪器有限公司)，垂直电泳槽和湿式转膜仪(北京六一仪器厂)。

1.2重组腺病毒载体构建本实验按照AdEasy系统构建重组腺病毒载体。通过PCR将人源BMP7、绿色荧光蛋白(GFP)及PTEN的编码序列进行扩增，PTEN的siRNA片段通过商业合成获得，然后将这些片段分别克隆到穿梭载体pAdTrace中，并重组。将正确的重组载体线性化，转染到HEK293细胞中，包装重组腺病毒。所得重组腺病毒分别命名为AdBMP7、AdPTEN和AdsiPTEN。重组腺病毒分别用GFP和红色荧光蛋白(RFP)标记，仅表达GFP的重组腺病毒(AdGFP)作为载体对照。

1.3细胞增殖检测将HCT116细胞接种至96孔板中(密度3×103每孔)，用不同浓度的Res、重组腺病毒或DMSO处理细胞24、48、72 h。检测时，每孔加入CCK-8 10 μL，并在37℃孵育4 h，用酶标仪在波长450 nm测定吸光度。每组实验重复3次。

1.4细胞周期及凋亡检测将HCT116接种在6孔板中，并用Res不同浓度(0、20、40、60 μmol·L-1)处理48 h。对于细胞周期分析，收集细胞并用4℃的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，用70%、50%、30%乙醇(4℃)固定。用PBS洗涤，加入含RNase(1 g·L-1)的碘化丙啶(PI，20 g·L-1)溶液1 mL，染色细胞30 min，最后用流式细胞仪测定。对于细胞凋亡分析，收集细胞并用PBS(4℃)洗涤后，采用Annexin V-EGFP & PI双染色法处理细胞，通过流式细胞仪进行分析。每组实验重复3次。

1.5总RNA提取及PCR实验将HCT116接种至T25瓶养瓶，贴壁后，用不同浓度的Res或DMSO处理细胞。用TRIzol试剂提取RNA，逆转录试剂盒制备cDNA，最后用半定量PCR检测目的基因的表达。PCR引物序列为：GAPDH，上游引物5′-CAACGAATTTGGCTACAGCA-3′，下游引物5′-AGGGGAGATTCAGTGTGGTG-3′；BMP7，上游引物5′-GGCAGGACTGGATCATCG-3′，下游引物5′-AAGTGGACCAGCGTCTGC-3′。每组实验重复3次。

1.6Westernblot实验将HCT116细胞接种至6孔板，用不同浓度Res或与相应的重组腺病毒处理。在设定的时间点，收集细胞裂解液并煮10 min。将所有样品进行SDS-PAGE电泳，并转移到PVDF膜上，依次与相应的一抗和辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，采用ECL试剂盒显影成像。每组实验重复3次。

2 结果

2.1Res对HCT116细胞增殖的影响CCK-8检测结果显示，Res能明显抑制HCT116细胞增殖(Fig 1A)。Western blot结果显示，Res能增加PCNA的水平(Fig 1B)，且呈浓度依赖性。细胞周期分析结果显示，Res明显增加S期细胞比例(Fig 1C)。结果提示，Res对HCT116细胞增殖有抑制作用。

Fig 1 Effects of Res on proliferation of HCT116 cells

A: CCK-8 assay results showed the anti-proliferative effect of Res on HCT116 cells; B: Western blot analysis results showed the effect of Res on protein level of PCNA in HCT116 cells, GAPDH was used as loading control; C: Flow cytometry analysis results showed the cell cycle arrest effect of Res in HCT116 cells.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

2.2Res对HCT116细胞凋亡的影响Western blot结果显示，Res在HCT116细胞中，升高Bad水平的同时，降低Bcl-2的水平(Fig 2A)。Annexin V-EGFP染色结果表明，Res能增加细胞凋亡数量(Fig 2B)。结果提示，Res对HCT116细胞的凋亡具有促进作用。

2.3Res对HCT116细胞中BMP7表达水平的影响Western blot结果显示，BMP7在常见的结肠癌细胞(HCT116、SW480、LoVo、HT29、CaCO2、SW620)以及FHC细胞中均有表达，但在结肠癌细胞中BMP7的表达要明显高于FHC细胞(Fig 3A)。PCR和Western blot分析结果显示，Res能以浓度和时间依赖的方式上调BMP7的mRNA和蛋白水平(Fig 3B、3C)。结果提示，Res抑制HCT116细胞增殖的作用可能与促进BMP7表达有关。

2.4BMP7对Res抑制HCT116细胞增殖作用的影响CCK-8测定结果显示，过表达BMP7能降低癌细胞的生存活力，且明显增强Res的抗增殖作用；BMP7抗体能部分逆转Res对HCT116细胞的抗增殖作用(Fig 4A)。Western blot结果表明，BMP7增加Res上调Bad水平的作用，同时也增强Res降低Bcl-2水平的作用(Fig 4B)。BMP7抗体减弱Res对Bad和Bcl-2蛋白水平的影响(Fig 4C)。结果提示，BMP7参与介导Res对人结肠癌细胞的增殖抑制作用，但具体机制不详。

Fig 2 Effects of Res on apoptosis-inducing in HCT116 cells

A: Western blot analysis results showed the effect of Res on protein levels of Bad and Bcl-2 in HCT116 cells, GAPDH was used as loading control; B: Annexin-V EGFP staining results showed the effect of Res on apoptosis in HCT116 cells.

Fig 3 Effects of Res on the expression of BMP7 in HCT116 cells

A: Western blot analysis results showed the endogenous expression of BMP7 in colon cancer cells and FHC cells, GAPDH was used as loading control; B: PCR analysis results showed the effect of Res on the mRNA expression of BMP7 in HCT116 cells; C: Western blot analysis results showed the effect of Res on protein level of BMP7 in HCT116 cells, GAPDH was used as loading control.

A: CCK-8 assay results showed the effect of BMP7 or BMP7 specific antibody on the anti-proliferation effect of Res on HCT116 cells.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsRes group; B: Western blot analysis results showed the effect of BMP7 on protein levels of Bad and Bcl-2 affected by Res in HCT116 cells, GAPDH was used as loading control; C: Western blot assay results showed the effect of BMP7 specific antibody on protein levels of Bad and Bcl-2 affected by Res in HCT116 cells, GAPDH was used as loading control.

2.5BMP7通过PI3K/Akt信号影响Res抑制HCT116细胞增殖的作用Western blot分析结果显示，Res对Smad1/5/8磷酸化水平无明显影响(Fig 5A)，但能降低Akt1/2和磷酸化Akt1/2/3(p-Akt1/2/3)的水平(Fig 5B)。提示BMP7对Res抗增殖作用的影响可能并非由经典BMPs/Smads信号介导，而是与PI3K/Akt信号有关。进一步Western blot检测结果显示，过表达BMP7增强Res降低Akt1/2和p-Akt1/2/3水平的作用(Fig 5C)，BMP7抗体明显减弱Res的这种作用(Fig 5D)。以上结果提示，Res抑制HCT116细胞增殖的作用可能与上调BMP7表达，进而抑制PI3K/Akt信号转导有关。

2.6BMP7和Res对HCT116细胞中PTEN磷酸化的影响Western blot分析结果显示，Res对HCT116细胞中PTEN的总蛋白水平无明显影响，但明显降低PTEN的磷酸化水平(Fig 6A)。过表达BMP7可增强Res降低PTEN磷酸化水平的作用(Fig 6B)，而BMP7抗体能减弱Res降低PTEN磷酸化水平的作用(Fig 6C)。结果提示，在HCT116细胞中Res可上调BMP7表达，从而抑制PTEN的磷酸化，最终降低PI3K/Akt信号的转导活性。

3 讨论

结肠癌是临床常见的恶性肿瘤，每年约60万人因患结肠癌而死亡[1]。尽管结肠癌的治疗已取得较大的进展，但预后仍不理想。因此，临床仍急需低毒而高效的药物来治疗结肠癌。本研究表明，Res能明显抑制HCT116细胞增殖并促进其凋亡，Res的这种作用可能与上调BMP7表达，进而抑制PTEN的磷酸化，并最终降低PI3K/Akt信号传导活性有关。

Res主要用作营养补充剂，具有保护心血管、抗血小板聚集、抗氧化、抗炎、降血糖等药理作用[11]。研究证明，Res可以抑制多种肿瘤细胞增殖，如结肠癌。研究表明， Res的抗癌活性可能与多种信号或因子有关，如抑制TNF-α、p38 MAPK、PI3K/Akt信号等[12]，但具体的分子机制尚不十分清楚。BMPs是属于TGF-β超家族成员，BMPs对细胞的增殖、分化和凋亡具有调节作用。因此，BMPs的功能异常与多种肿瘤有关，如BMP2、BMP6、BMP7[8]。BMPs不但能通过BMPs/Smads信号实现对多种生理过程的调节，还可通过非经典BMPs/Smads信号发挥作用，如PI3K/Akt、MAPK、NF-κB等[13]。在本研究中，我们发现Res可以提高HCT116细胞中BMP7的水平，外源性BMP7能增强Res对HCT116细胞增殖抑制作用，但BMP7抗体明显减弱Res的这种抗增殖作用。提示BMP7可能参与介导Res对HCT116细胞的抗增殖活性，但机制仍不清楚。

Fig 5 Effects of BMP7 on PI3K/Akt signaling affected by Res in HCT116 cells

A: Western blot analysis results showed the effect of Res on protein levels of Smad1/5/8 and p-Smad1/5/8, GAPDH was used as loading control; B: Western blot analysis results showed the effect of Res on protein levels of Akt1/2 and p-Akt1/2/3 in HCT116 cells, GAPDH was used as loading control; C: Western blot analysis results showed the effect of BMP7 on protein levels of Akt1/2 and p-Akt1/2/3 affected by Res in HCT116 cells, GAPDH was used as loading control; D: Western blot analysis results showed the effect of BMP7 specific antibody on protein levels of Akt1/2 and p-Akt1/2/3 affected by Res in HCT116 cells, GAPDH was used as loading control.

Fig 6 Effects of BMP7 on phosphorylation of PTEN affected by Res in HCT116 cells

A: Western blot analysis results showed the effect of Res on protein level of PTEN and p-PTEN in HCT116 cells, GAPDH was used as loading control; B: Western blot analysis results showed the effect of BMP7 on protein level of PTEN and p-PTEN affected by Res in HCT116 cells, GAPDH was used as loading control; C: Western blot analysis results showed the effect of BMP7 specific anti-body on protein level of PTEN and p-PTEN affected by Res in HCT116 cells, GAPDH was used as loading control.

由于BMPs可通过经典和非经典BMPs/Smads信号发挥调节作用，因此，本研究对两种信号转导活性进行分析。结果发现，Res对Smad1/5/8的磷酸化无明显影响，而Res本身能促进BMP7表达。提示BMP7可能通过非经典BMPs/Smads信号介导Res的抗结肠癌作用。PI3K/Akt信号对细胞的增殖、存活和分化具有调节作用，在多种肿瘤中被过度激活，并且也是一种非经典的BMP/Smads信号。Res能抑制肿瘤细胞中的PI3K/Akt信号[4]，本研究经Western blot分析也证明，Res能抑制Akt磷酸化。因此，我们推测Res对PI3K/Akt信号的抑制作用可能与其促进BMP7表达有关。实验结果显示，BMP7过表达可增强Res对PI3K/Akt信号的抑制作用，而BMP7抗体则减弱Res对HCT116细胞中PI3K/Akt信号的影响。提示在HCT116细胞中，BMP7可能通过抑制PI3K/Akt信号传导来介导Res的抗增殖活性。但BMP7在干细胞中能激活PI3K/Akt信号[14]，导致这种不同的效应可能与细胞种类以及细胞所处微环境有关。PI3K/Akt信号受到多种因子调节，如可被IGF激活，但能被PTEN抑制。我们推测，BMP7在HCT116细胞中对PI3K/Akt信号转导的抑制作用可能与上调PTEN有关。结果显示，Res对HCT116细胞中PTEN的总蛋白水平无明显影响，但可以明显降低PTEN的磷酸化平，与文献报道相一致[15]。BMP7过表达能增强Res降低PTEN磷酸化水平的作用，而BMP7抗体则明显减弱Res在HCT116细胞中抑制PTEN磷酸化的作用。

本研究结果表明，Res对人结肠癌细胞增殖具有抑制作用，可能是一种治疗结肠癌的有效药物。Res的这种作用可能与其促进BMP7表达而抑制PTEN磷酸化，最终使PI3K/Akt信号转导活性降低有关。课题组将进一步确认在其他结肠癌细胞中Res对BMP7表达的影响及相关分子机制，为Res用于临床预防和治疗结肠癌提供依据。

[致谢：本实验在重庆市生物化学与分子药理学重点实验室完成。 感谢何通川教授(T.C.HE，芝加哥大学医学中心)为本实验馈赠所需的重组腺病毒载体。]

参考文献：

[1] Brenner H, Kloor M, Pox C P.Colorectal cancer [J].Lancet, 2014,383(9927):1490-502.

[2] Tran N H, Cavalcante L L, Lubner S J, et al.Precision medicine in colorectal cancer: the molecular profile alters treatment strategies [J].TherAdvMedOncol, 2015,7(5):252-62.

[3] Noh J K, Naeem M, Cao J, et al.Herceptin-functionalized pure paclitaxel nanocrystals for enhanced delivery to HER2-postive breast cancer cells [J].IntJPharm, 2016,513(1-2):543-53.

[4] Liu Y Z, Wu K, Huang J, et al.The PTEN/PI3K/Akt and Wnt/beta-catenin signaling pathways are involved in the inhibitory effect of resveratrol on human colon cancer cell proliferation [J].IntJOncol, 2014,45(1):104-12.

[5] 陈前昭, 曾于桦, 邵 英, 等.白藜芦醇抑制人结肠癌细胞增殖与p38 MAPK的关系研究 [J].中国药理学通报, 2016,32(8):1110-4.

[5] Chen Q Z, Zeng Y H, Shao Y, et al.Study on the relationship between p38 MAPK and the anti-proliferation effect of resveratrol in human colon cancer cells[J].ChinPharmacolBull, 2016,32(8):1110-4.

[6] Bragdon B, Moseychuk O, Saldanha S, et al.Bone morphogenetic proteins: a critical review [J].CellSignal, 2011,23(4):609-20.

[8] Peng J, Yoshioka Y, Mandai M, et al.The BMP signaling pathway leads to enhanced proliferation in serous ovarian cancer—a potential therapeutic target [J].MolCarcinog, 2016,55(4):335-45.

[9] Ren C M, Li Y, Chen Q Z, et al.Oridonin inhibits the proliferation of human colon cancer cells by upregulating BMP7 to activate p38 MAPK [J].OncolRep, 2016,35(5):2691-8.

[10] Mundi P S, Sachdev J, McCourt C, et al.AKT in cancer: new molecular insights and advances in drug development [J].BrJClinPharmacol, 2016,82(4):943-56.

[11] Sadi G, Bozan D, Yildiz H B.Redox regulation of antioxidant enzymes: post-translational modulation of catalase and glutathione peroxidase activity by resveratrol in diabetic rat liver [J].MolCellBiochem, 2014,393(1-2):111-22.

[12] Yuan S X, Wang D X, Wu Q X, et al.BMP9/p38 MAPK is essential for the antiproliferative effect of resveratrol on human colon cancer [J].OncolRep, 2016,35(2):939-47.

[13] Sánchez-Duffhues G, Hiepen C, Knaus P, et al.Bone morphogenetic protein signaling in bone homeostasis [J].Bone, 2015,80(11):43-59.

[14] Wang Z, Guo J.Mechanical induction of BMP-7 in osteocyte blocks glucocorticoid-induced apoptosis through PI3K/AKT/GSK3beta pathway [J].CellBiochemBiophys, 2013,67(2):567-74.

[15] Jing X, Cheng W, Wang S, et al.Resveratrol induces cell cycle arrest in human gastric cancer MGC803 cells via the PTEN-regulated PI3K/Akt signaling pathway [J].OncolRep, 2016,35(1):472-8.