3种离子液体对脂肪酶催化鱼油酯交换产物ω-3脂肪酸的影响

李梦琪， 傅 红, 2， 张翠平， 欧阳全兴， 王 琳， 叶秀云, 2

(1. 福州大学生物科学与工程学院， 福建 福州 350116； 2. 福建省海洋酶工程重点实验室， 福建 福州 350116)

0 引言

离子液体是指在室温环境下呈现液态的、 完全由阴阳离子组成的低温熔融盐， 一般由有机阳离子和无机阴离子构成. 与传统有机溶剂相比， 离子液体具有热稳定性高、 蒸汽压低和对环境友好等特点， 被称为“绿色”溶剂. 近年来离子液体作为各类酶反应的反应介质备受关注[1-3]. 自Rantwijk等[4-5]在一些酶催化的酯化反应中运用离子液体代替传统有机溶剂以来， 许多研究表明离子液体作为脂肪酶催化反应的媒介， 可能影响酶分子周围的微水相环境， 并改变酶与底物的接触面积以及与底物间的相互影响， 从而提高脂肪酶的稳定性和增强酶活力.

天然形式的深海鱼油是甘油三酯型， 其EPA(eicosapentaenoic acid)和DHA(docosahexaenoic acid)的总含量一般在18%～30%(质量分数， 以下均同)左右. 通过甲乙酯化反应及分子蒸馏技术可将产物甲乙酯型鱼油的EPA和DHA总含量提高至70%左右. 但现代医学研究表明， 从人体吸收率和对甲乙醇敏感的人群而言， 甘油三酯鱼油在食用安全性上比甲乙酯型鱼油更具优势[6]， 因此提高甘油三酯型鱼油中ω-3多不饱和脂肪酸含量的技术已成为研究热点. 目前大量学者采用在无溶剂体系或有机溶剂体系下的脂肪酶催化酯交换反应来提高甘油三酯中EPA和DHA的质量百分含量， 总含量大多在50%左右[7-9]. 李金章等[10]从多种脂肪酶中筛选了TLIM作为催化剂， 催化鱼油甘油酯与乙酯发生酯交换反应， 得到了EPA和DHA总含量为45.6%的甘油酯鱼油. 宋诗军等[11]在无溶剂体系下利用Novozyme435催化浓缩鱼油乙酯与ω-3脂肪酸含量为43%的混合甘油酯进行酯交换反应， 产物甘油酯中的EPA和DHA含量分别可达40.4%和28.6%. 但是到目前为止， 还没有对离子液体应用在脂肪酶催化的鱼油酯交换反应中的效果有明确的研究报道. 因此， 本研究以3种易于合成且性质稳定的二烷咪唑类离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐([BMIM][BF4])、 1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐(BMIM][PF6])和1-丁基-3甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐([BMIM][Tf2N])分别作为鱼油酯交换反应的介质[12]， 研究3种离子液体对脂肪酶催化活力和脂肪酶催化鱼油酯交换反应产物ω-3脂肪酸的影响.

1 材料与方法

1.1 实验试剂与原料

甘油三酯型鱼油(EPA： 19.21%； DHA： 10.81%)、 乙酯型鱼油(EPA： 42.47%； DHA： 31.91%)由福建高龙海洋生物工程有限公司惠赠； Novozyme435酶、 TLIM酶， 购自丹麦诺维信公司； 猪胰脂酶购自上海三杰生物技术有限公司； 离子液体[BMIM][BF4]、 [BMIM][PF6]、 [BMIM][Tf2N]， 购自上海成捷化学有限公司， 其主要物理性质如表1所示； 其他化学试剂均为国产分析纯.

表1 3种离子液体的主要物理性质

1.2 实验方法

1.2.1 鱼油理化性质测定

水分及挥发物的测定参考《动植物油脂水分及挥发物含量测定(GB/T 5528—2008)》[13]； 酸值的测定参考《动植物油脂酸值和酸度测定(GB/T 5530—2005)》[14]； 皂化值的测定参考《动植物油脂皂化值的测定(GB/T 5534—2008)》[15]； 碘值的测定参考《动植物油脂碘值的测定(GB/T 5532—2008)》[16]； 过氧化值的测定参考《动植物油脂过氧化值测定(GB/T 5538—2005)》[17].

1.2.2 离子液体中酶活的测定方法

参考国家标准《脂肪酶制剂(GB/T 23535—2009)》[18]， 用恒电位自动滴定法测定脂肪酶在离子液体中催化橄榄油的水解活性. 将40 mL磷酸盐缓冲液和2 mL橄榄油的混合溶液(空白对照样品)， 或40 mL磷酸盐缓冲液和2 mL橄榄油的混合溶液及定量的离子液体加入到100 mL烧杯中(TLIM酶不加磷酸缓冲液)， 放入30 ℃恒温水浴中预热30 min. 预热完成后， 用0.1 mol·L-1NaOH和0.1 mol·L-1HCl调节pH值至7.0后， 加入准备好的酶液2 mL， 用0.1 mol·L-1NaOH开始滴定， pH值恒定不变， 记录15 min内消耗的NaOH标准溶液体积(V，mL)， 以同样方法滴定空白溶液， 消耗的NaOH 标准溶液体积作为空白值(V0，mL). 测定条件下每分钟催化产生1 μmol脂肪酸的酶活性为1个酶活力单位. 酶活力 (μmol·min-1) 按照式(1)计算， 相对酶活力(%)按照式(2)计算[19].

(1)

(2)

1.2.3 酯交换反应及产物分离

将5 g乙酯型鱼油与5 g甘油三酯型鱼油搅拌混匀， 混匀的底物装入已经设置为52 ℃的超级恒温水浴锅中的双层烧杯中， 加入底物质量分数为3%(0.3 g)的脂肪酶及不同质量分数(0%、 2%、 4%、 6%、 8%和10%)的离子液体， 密封避光， 待反应24 h后终止反应. 过滤反应产物， 除去脂肪酶固体， 离心分层， 上层液体即为混合鱼油. 将产物点样至层析板上进行层析[7]， 显色后刮下甘油三酯部分的层析硅胶， 待甲酯化反应使用.

1.2.4 甲酯化及气相色谱分析

取经硅胶层析分离出的鱼油样品(甘油三酯)， 装在50 mL容量瓶中， 加入10 mL 0.5 mol·L-1氢氧化钠-甲醇溶液， 在65 ℃的恒温水浴中皂化20 min使油珠完全溶解， 然后冷却； 再加入甲醇-三氟化硼乙醚溶液(三氟化硼-乙醚溶液与无水甲醇以1∶3(体积比)配制而成， 现配现用)， 将混合物在70 ℃恒温水浴中沸腾20 min； 取出冷却后， 加入10 mL正己烷， 并充分振荡[20]， 使脂肪酸甲酯溶于正己烷溶剂中； 再加入饱和NaCl溶液， 至距离容量瓶口大约2 cm处， 此时， 容量瓶上层液体即为正己烷， 用注射器抽出上层溶液， 放入试管中， 用氮吹仪将溶剂除去， 收集甲酯化样品供分析之用.

采用GC7890气相色谱仪， Agilent 112-88A7 HP-88毛细管色谱柱， 其规格为100 m×250 μm×0.20 μm. 检测器为火焰离子化检测器(FID)， 载气为纯氮气， 其流速为1.0 mL·min-1， 氢气流速为35.0 mL·min-1， 空气流速为350 mL·min-1. 进样口温度设为250 ℃， 检测器温度设为280 ℃. 程序升温： 柱温140 ℃保持5 min， 以4 ℃·min-1程序升温至220 ℃， 持续保持35 min； 尾吹气为氮气， 流速45 mL·min-1； 进样量1 μL， 进样方式： 分流， 分流比20∶1(体积比)[21].

平行试验3次.

2 结果与讨论

2.1 原料鱼油理化性质

脂肪酶酶解反应的底物甘油三酯型鱼油及乙酯型鱼油， 其理化性质指标如表2所示. 研究所选用的作为反应底物的原料鱼油各项理化性质指标都符合国家对鱼油食用标准的一级标准[22].

表2 反应底物甘油三酯及乙酯型鱼油的理化性质

2.2 离子液体对脂肪酶活力的影响

特异性脂肪酶TLIM、 猪胰酯酶和非特异性脂肪酶Novozyme435是在鱼油酯交换反应中最常用且效果较好的3种脂肪酶[7, 23]. 分别在亲水性离子液体[BMIM][BF4]、 两种疏水性离子液体[BMIM][PF6]及[BMIM][Tf2N]中对上述脂肪酶的催化活性进行测定， 相对不加离子液体的酶活力结果如图1所示.

由图1可知， 与不含离子液体的磷酸盐反应体系相比， 3种脂肪酶在不同离子液体介质中的酶活力均显著增加. 其中， 在亲水性离子液体[BMIM][BF4]中达到最大相对酶活， TLIM、 猪胰脂酶及Novozyme435对应的[BMIM][BF4]最适质量浓度均为45 g·L-1左右， 最大相对酶活力分别为1 030%， 1 090%和687%. 此外， 结果还表明3种脂肪酶在两种疏水性离子液体[BMIM][PF6]、 [BMIM][Tf2N]中的酶活变化趋势大致相同， 达到最大相对酶活力时的离子液体质量浓度均为30 g·L-1左右. 相关研究[4, 19]表明这3种离子液体可大幅度提高脂肪酶活力， 可能是由于离子液体对油水混合体系的乳化效果更好， 离子液体的加入可有效增大底物的溶解度从而增大底物和酶接触机会[24]， 为脂肪酶的催化反应提供一个更加紧凑适宜的微环境[25].

图1 3种离子液体对脂肪酶活力的影响Fig.1 Effect of the three ionic liquids on lipase activity

由图1还可知， 脂肪酶在离子液体中的相对酶活力随离子液体浓度的增加均呈先增后减的趋势， 这可能是由于随着离子液体添加量的增加， 反应底物浓度及反应速率降低了， 不利于反应的正向进行； 同时， 与有机溶剂及甘油三酯相比， 离子液体的黏度较大， 导致反应体系的黏度随离子液体添加量的增大而增大， 当黏度增大到一定程度， 反应体系的传质阻力增大[1, 26]， 阻碍底物与酶分子的相互作用， 不利于反应进行.

2.3 离子液体对脂肪酶催化鱼油酯交换反应的影响

图1的结果表明离子液体可大幅提高脂肪酶活力， 因此将3种离子液体应用在以甘油三酯型鱼油和乙酯型鱼油为底物的鱼油酯交换反应中， 其中甘油三酯型鱼油的ω-3脂肪酸质量分数为30.02%， 乙酯型鱼油的ω-3脂肪酸质量分数为74.38%. 考察离子液体添加量对产物甘油三酯鱼油中EPA和DHA质量分数的影响， 结果如图2所示.

图2 3种离子液体添加量对鱼油酯交换反应的影响Fig.2 Effect of the three ionic liquids additive amount on transesterification of fish oil

由图2可知， 离子液体使鱼油酯交换反应产物甘油三酯EPA和DHA的平均得率提高了20%以上. 其中， 当使用特异性脂肪酶TLIM和猪胰脂酶， 并以疏水性离子液体[BMIM][Tf2N]或[BMIM][PF6]作为反应介质时， 产物甘油三酯鱼油中ω-3脂肪酸的质量分数较高. 当[BMIM][Tf2N]添加量为4%(质量分数， 以下同)时， TLIM催化鱼油酯交换产物甘油三酯的EPA和DHA总质量分数达到了63.65%， 较不加离子液体的空白对照样提高了11.79 %.

对于鱼油酯交换反应而言， 上述实验结果有两个显著特征， 一是具有位置特异性的脂肪酶TLIM和猪胰脂酶反应效果优于非特异性脂肪酶Novozyme435； 二是疏水性离子液体效果优于亲水性离子液体. 究其原因， 可能和反应体系特征密切相关. 研究表明， EPA和DHA等多不饱和脂肪酸大部分连接在甘油三酯的2位[27]， 而Sn-1, 3特异性脂肪酶选择性水解鱼油时， 可以更多地作用于甘油酯1和3位置上的脂肪酸进行酯交换反应， 从而最大程度地使甘油酯2位置上的脂肪酸保留下来， 最终提高反应产物中ω-3脂肪酸的质量分数. 另一方面， 虽然由前述离子液体对脂肪酶活力的影响效果来说， 3种脂肪酶在亲水性离子液体[BMIM][BF4]中酶活较高， 但是其对应的酶活测定体系是含有磷酸缓冲液的含水体系， 酶活指标反映的主要是脂肪酸的水解得率， 因此和无水溶剂的酯交换反应有所不同. 由于鱼油酯交换反应在非水溶剂体系下进行， 而疏水性离子液体在非水相体系下， 可最大程度地增加底物与酶的接触机会， 使得酶外围的水分子层的介电常数比离子液体更高， 导致酶与水分子结合牢固， 空间形态结构不易改变， 因此酶的催化活性能够得以维持， 有利反应进行. 另外PF6-、 Tf2N-的负电荷比较分散， 形成氢键的能力较弱， 对酶的分子结构影响较小[4]. 这可能是在非水环境下鱼油酶法酯交换反应中疏水性离子液体效果要好于亲水性离子液体的主要原因.

2.4 产物脂肪酸成分分析

为了考察离子液体对鱼油酶法酯交换产物脂肪酸的影响效果， 研究以TLIM脂肪酶为例， 分别对不添加离子液体及[BMIM][Tf2N]为最佳添加量(4%)时， 酯交换反应产物甘油三酯的脂肪酸成分及脂肪酸质量分数进行对比分析， 结果如表3所示.

表3 离子液体[BMIM][Tf2N]为介质的反应产物甘油三酯脂肪酸组成及含量

注： TG代表甘油三酯； EE代表乙酯

由此可见， 离子液体体系下产物甘油三酯型鱼油的EPA质量分数为40.31%， DHA质量分数为23.34%， 总质量分数达到了63.65%， 远高于底物甘油三酯型鱼油的EPA和DHA总质量分数30.02%， 同时也显著高于非离子液体体系下的脂肪酶TLIM催化反应产物甘油三酯EPA和DHA总质量分数51.86 %. 因此， 以离子液体为介质可以提高脂肪酶催化鱼油酯交换反应产物甘油三酯中EPA和DHA质量分数. 酯交换反应主要是甘油三酯型底物鱼油中的C14∶0、 C16∶0、 C16∶1和C18∶1与乙酯型底物鱼油中的EPA和DHA进行了交换， 从而提高了产物甘油三酯鱼油中EPA和DHA的质量分数.

3 结语

离子液体作为一种新型“绿色”溶剂， 已替代传统有机溶剂作为各种酶促反应的介质. 研究表明TLIM、 Novozyme435及猪胰脂酶3种脂肪酶在离子液体[BMIM][BF4]、 [BMIM][PF6]、 [BMIM][Tf2N]中的酶活均有提升. 其中， 当[BMIM][BF4]质量浓度为45 g·L-1时， 猪胰脂酶的相对酶活力达到1 090%. 将离子液体加入鱼油酯交换反应中作为反应介质后， 鱼油酯交换反应产物甘油三酯EPA和DHA的平均得率提高了20%以上， 且疏水性离子液体效果好于亲水性离子液体. 当[BMIM][Tf2N]添加量为4%时， TLIM催化鱼油酯交换产物甘油三酯的EPA和DHA总质量分数达到了63.65%， 较不加离子液体提高了11.79%.

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