组织工程技术再生卵巢的初步研究*

杨如镜 潘婷 林丽娜 黄晓帆 吴淑卿 王兴玲

由卵巢肿瘤、性腺发育不全等导致的卵巢功能衰竭成为辅助生殖技术最大难题。2004年，Johnson等首次提出卵巢中存在生殖干细胞[1]，随后证实了出生后的小鼠卵巢中存在卵母细胞和卵泡的更新[2]。其他研究者也分别分离、培养了新生及成年小鼠，以及人的卵巢干细胞（Germline stem cells）[3-5]。这些发现为卵巢衰竭患者带来了新的希望。组织工程技术再生卵巢是利用卵巢来源的细胞、生物材料及组织工程技术构建人工卵巢，移植入体内，达到提高这些患者生活质量如内分泌激素分泌或最终生殖能力的改善等目的[6-7]。用于再生医学的生物材料有多种，笔者使用明胶海绵作为支架，种植标记来源于小鼠卵巢的细胞，初步探讨卵巢细胞移植后存活情况，观察明胶海绵体内降解情况，以期为今后构建人工卵巢提供参考，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 使用8～12周SPF级KM雌鼠，购于汕头医学院实验动物中心，饲养在温度22～25 ℃，12 h 光照，12 h 黑暗的环境中。

1.1.2 生物材料支架 可吸收Ⅰ型胶原海绵（typeⅠ absorbable collagen sponge，Integra Lifesciences，美国）。

1.1.3 荧光标记物 CellTrackerTMCM-DiI（Invitrogen，美国），储存液配制：用二甲基亚砜（DMSO）配制为2 mg/mL，分装后保存于-20 ℃，避免反复冻融。工作液配制：使用前用PBS配制，浓度为1 μM。

1.1.4 消化酶 用不含血清的DMEM/F12配制终浓度为 3 mg/mLⅠ型胶原酶（typeⅠ collagenase，sigma，美国）及 4 mg/mL 中性蛋白酶（dispase，sigma，美国），分装后-20 ℃备用，避免反复冻融。

1.2 方法

1.2.1 卵巢细胞分离 取6只雌鼠，脱颈椎处死，75%酒精消毒腹部皮肤后剪开皮肤及腹腔，找到输卵管及卵巢，在体视显微镜下分离出卵巢，尽量去除卵巢周围的脂肪及结蹄组织，换干净培养皿，用无菌眼科剪碎后加消化酶。37 ℃孵育30 min后，过70 μm细胞滤网（BD，美国），离心，洗涤。

1.2.2 细胞培养及荧光标记 分离的细胞接种于含10%胎牛血清的DMEM/F12（Gibco 低糖，美国）24孔板中，放入6%CO2培养箱。24 h细胞贴壁后换液，继续培养至3 d准备荧光标记。荧光标记物采用 CellTrackerTMCM-DiI（invitrogen，美国）。贴壁细胞用 PBS洗涤后，加入 0.5 mL CM-DiI工作液，37 ℃孵育5 min，然后放入碎冰上继续孵育15～20 min。去除染色液，用 PBS洗涤 2次后，加入新鲜培养液放入培养箱培养。不同时间荧光显微镜观察、计数标记细胞比例。培养的标记细胞计数方法：选择培养孔中不同区域荧光显微镜计数标记细胞，然后去除培养液，PBS洗涤2次后加入 1 μg/mL DAPI（Sigma，美国）染色 5～10 min，荧光显微镜计数同样区域的细胞核。每个时间点最少计数3孔、5个区域细胞，计算平均值。新鲜分离悬浮细胞荧光标记：取12只雌鼠，分离卵巢组织，剪碎的组织酶消化、离心、PBS洗涤后，加入CM-DiI工作液0.5～1.0 mL至每个离心管中，37 ℃水浴孵育5 min，然后离心管放入碎冰中继续孵育15～20 min，离心去除染色液，PBS洗涤2次后，悬浮于少量培养液（细胞终浓度为5×106/mL）中待用。

1.2.3 构建移植体及小鼠皮下移植 胶原海绵支架用手术刀切成3×6 mm，放置入干燥的6孔板，200～300 μL荧光标记的卵巢细胞种植于明胶海绵支架中。将种植细胞的支架放入培养箱2～3 h，等待细胞黏附于海绵支架。6只8～12周小鼠，腹腔注射2%戊巴比妥钠0.1 mL，麻醉后腹卧于手术台上，常规消毒背部皮肤，用手术剪沿背部正中矢状线剪开皮肤约1 cm，用组织钳分离皮下组织，取出种植细胞的移植体，仔细放入小鼠背部皮下，缝合切口。小鼠放回后观察复苏后活动情况。3只小鼠移植后7 d脱颈椎处死，取出移植体，快速冰冻切片、DAPI染液封片，荧光显微镜下观察。3只小鼠移植后3周脱颈椎处死，取出移植体，10%福尔马林固定，石蜡包埋切片，HE染色后显微镜观察。

2 结果

2.1 卵巢分离细胞的培养 卵巢分离的细胞有多种类型，如成纤维细胞、颗粒细胞、内皮细胞以及来源于卵巢皮质的生殖干细胞等。24 h换液后，只有贴壁细胞如成纤维细胞、颗粒细胞等可以继续生长，用于观察细胞示踪剂CM-DiI对卵巢细胞的标记以及荧光信号的动态变化。

2.2 培养细胞的荧光标记及动态观察 CellTrackerTMCM-DiI为DiI衍生物，低细胞毒性，含有能与硫醇反应的氯甲基基团，使染料可以共价结合到细胞硫醇上。这样，与其他膜染料不同，细胞在分裂时荧光染料可以进入子细胞，保持荧光强度达数个细胞分裂周期，并可在细胞固定和渗透步骤中保持稳定的标记。本实验在标记后24 h观察，98.3%的细胞被标记。培养3 d时可观察到个别细胞从贴壁变为悬浮，以后逐渐增加，悬浮的细胞荧光信号逐渐减弱。1周后，荧光标记细胞比例为66.4%，大部分悬浮细胞荧光信号消失；培养至2周，几乎所有细胞失去荧光信号。提示用于移植细胞体内示踪，在短期体内实验（1周内）是一种方便使用、荧光信号较强及可靠的示踪剂。体外培养细胞CM-DiI荧光标记，见图1。荧光信号动态变化，见表1。

图1 体外培养的卵巢细胞示踪剂染色（×20）

表1 CM-DiI标记卵巢细胞荧光信号的动态变化

2.3 移植体在小鼠体内的存活 构建的卵巢细胞-生物支架移植体在植入动物体内1周后，冰冻切片荧光显微镜观察可见到大量的移植卵巢细胞，说明胶原海绵支持卵巢细胞在体内的生长。移植3周后，石蜡包埋切片HE染色，可见到胶原海绵支架仍未被降解，细胞在支架空隙中大量生长，并有类似于血管的结构生成，见图2。但未发现典型的卵泡样结构，可能与笔者分离细胞时过细胞滤网，原始或窦前卵泡被滤除有关。

图2 卵巢细胞-生物支架动物移植3周后移植体内细胞及支架的变化（HE染色，×100）

3 讨论

组织工程技术是近年新兴的一门学科，是利用生物学、材料科学及工程学原理研发生物组织器官替代品，达到恢复或改善疾病或创伤组织器官的功能及形态的目的[6-7]。构建三维人工卵巢替代卵巢组织冷冻移植，成为恢复女性内分泌及生殖功能的又一选择[8-9]。笔者用可降解的Ⅰ型胶原海绵作为生物支架，与血纤维蛋白（fibrin）、基质胶（matrigel）及水凝胶（hydrogel）相比[10-12]，海绵材料有孔隙，除了可以为卵巢细胞提供附着支架外，支架中的孔隙还可以为卵巢细胞的生长、迁移提供空间，有利于营养物质、生长因子及内分泌因子的运输以及血管的生成[13-16]。卵巢细胞用CM-DiI标记，体外实验显示，细胞1周后仍有66.4%的细胞标记，是一种理想的短期体内实验细胞示踪剂。体外培养还观察到，培养1周后发生部分细胞脱壁，悬浮在培养液中，可能使细胞发生凋亡，这些细胞荧光信号也逐渐淬灭，提示对活细胞示踪的影响较小。

体内移植组织切片显示胶原蛋白海绵支持卵巢细胞生长，在海绵的孔隙中细胞生长旺盛，并发现类似血管样结构，说明所用生物支架具有良好的组织相容性，支持卵巢细胞的体内生长，可作为今后构建人工卵巢的生物材料。

构建人工卵巢的巨大挑战是分离有生殖功能的细胞，如原始卵泡或卵巢生殖干细胞。分离原始卵泡构建人工卵巢已有多个研究，与冷冻卵巢组织移植相比，对卵巢肿瘤患者可降低肿瘤再发风险[10]。卵巢干细胞的优势是可以体外增殖，有望成为恢复或重建卵巢生殖功能的一个新的生殖细胞来源。本研究也为今后利用组织工程技术构建人工卵巢，治疗卵巢早衰提供了一个新途径。

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