顶空固相微萃取法对两种大豆发酵豆豉挥发性成分的比较

谢兰心，樊晓博

(渭南职业技术学院，陕西 渭南　714000)

豆豉，我国古代称之为“幽菽”，是一种以黄豆或黑豆为原材料，经细菌或霉菌发酵而成的调味品,有着悠久的历史[1]。在我国不同的地区，豆豉的制作方法各有特色。依据发酵优势菌群的不同，豆豉被分为霉菌型和细菌型；按加工原材料的不同，可分为黑豆豆豉和黄豆豆豉；根据加工过程是否添加食盐，可分为淡豆豉和咸豆豉。作为传统发酵豆制品，豆豉富含蛋白质和各种氨基酸，营养丰富，味道鲜美[2]，且含有人体所需的多种维生素和矿物质,具有一定的保健作用[3]，广受我国人民群众的喜爱。

不仅在我国，亚洲其他地区也有发酵豆制品的身影，如日本的纳豆和东南亚的天培。然而，这两者的发展现状和世界范围内的影响力已远超豆豉。纳豆不仅在日本广受欢迎，而且已辐射到周边国家。国外科学家研究发现，纳豆不仅能够抗癌，而且能起到一定的溶解血栓功能[5]；研究结果一经发布，纳豆的发展势头更是令人瞩目[4]。东南亚的天培则随着印尼移民的足迹传到了美洲、欧洲和非洲，科学家对其进行了深入的研究，发现天培具有良好的防癌、抗氧化功效，这使得天培跻身于世界高档食品市场，身价倍增。反观我国豆豉，虽然历史悠久，营养丰富，但目前对它的研究仅有异黄酮和抗氧化功能2个方面，其他方面仍有待进一步研究。目前我国许多豆豉生产厂家仍采用传统发酵工艺，生产规模和产品档次均无法满足消费者的需求，发展前景堪忧。

至于风味，目前在我国，已有人对细菌型豆豉的香味成分进行了分析[6]，但是，作为中国豆豉主流产品的霉菌型豆豉,其香味成分研究却少见报道[7,8]。

为了研究原料豆经发酵后的理化性质改变，首先对原料豆(黑豆和黄豆)的各理化性质进行测定和对比，主要包括水分、蛋白质、脂肪和灰分等。以曲霉为主要菌种制作豆豉，只加入少量食盐以保持豆豉的原味。至于风味物质的提取，采用了顶空固相微萃取法。并通过GC-MS联用和气相吸闻技术对2种豆豉的风味物质进行了鉴定和比较。最后，对成品豆豉的理化性质进行了比较。

1　材料与方法

1.1　实验材料

1.1.1仪器

Agilent 6890N/5975MSD气质联用仪、DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器、DK-98-11A电热恒温水浴锅、DZF-6021真空干燥箱、DHG-9123电热恒温鼓风干燥箱、分析天平、电子天平、DHG-9123电热恒温鼓风干燥箱、SP-752型UV-Vis分光光度计、电子万用炉、DH3600B电热恒温培养箱、SHA-B恒温振荡器、手提式蒸汽灭菌锅、通风橱、打粉机、索氏提取器、微量凯氏定氮装置。

1.1.2试剂

黑豆(black bean)、黄豆(soybean)、乙醚、浓硫酸、氢氧化钠、二氯甲烷、正戊烷、盐酸、硼酸、甲基红、茚三酮、3,5-二硝基水杨酸，以上试剂均为分析纯。

1.2　实验方法

1.2.1理化指标的测定

1.2.1.1水分含量的测定

将黑豆、黄豆、黑豆豉和黄豆豉在粉碎机中打成粉末状，取清洁干燥的干燥瓶，在分析天平上称取干燥瓶重量并记录，准确称取2 g左右粉末于干燥瓶内，记录样品和瓶的重量，将样品置于真空干燥箱内烘干12 h，烘干完成后精确称干燥后样品和瓶的重量并计算。

1.2.1.2凯氏定氮法测粗蛋白含量

称取0.3 g左右样品粉末于消化瓶中，采用凯氏定氮法测定样品中粗蛋白含量并记录。

1.2.1.3脂肪含量的测定

用分析天平称取2 g左右干燥样品，索氏抽提法测定样品脂肪含量并记录。

1.2.1.4粗灰分的测定

将瓷坩埚置于马福炉灼烧0.5 h，冷却后精确称量并记录；称取粉碎干燥后的2 g左右样品，将样品放入坩埚中，记录质量。

将装有样品的坩埚放入马福炉中，在500～600 ℃灼烧至无炭粒(即灰化完全)。冷却到200 ℃以下时，移入干燥器中冷却，待冷却至室温后称量，重复灼烧至前后2次称量差不超过0.5 mg为恒重。最后冷却后精确称量坩埚和总灰分的质量并计算。

1.2.1.5茚三酮法测豆豉中氨基酸的含量

配制茚三酮溶液；制作异亮氨酸标准曲线；样品处理及测定：

称取粉末状样品各5 g左右，并准确记录；加入50 mL蒸馏水，放置于电炉上加热煮沸，再无损地过滤至100 mL容量瓶中，用热水洗涤残渣数次，定容至100 mL；再吸取10 mL定容后的溶液于100 mL容量瓶中，定容至100 mL。取样液加入现配的茚三酮溶液，摇匀后静置15 min，在570 nm波长下比色，并记录计算。

1.2.1.6总酸的测定

用已知浓度的盐酸溶液标定氢氧化钠溶液；测定方法：

称取粉末状样品各5 g左右，并准确记录；加入50 mL蒸馏水并煮沸，再无损过滤至100 mL容量瓶中，用热水洗涤残渣数次，后定容至100 mL；再吸取10 mL定容后溶液于100 mL容量瓶中，定容至100 mL。吸取20 mL样品，滴入2滴酚酞，用已标定的氢氧化钠溶液滴定至初显粉色，即为终点。记录消耗的氢氧化钠溶液体积，据此计算样品中总酸的含量。

1.2.1.73,5-二硝基水杨酸法测定还原糖(DNS法)

制作葡萄糖溶液标准曲线；样品处理及测定：

称取豆豉样品3 g左右，并准确记录，加入50 mL蒸馏水于50 ℃水浴20 min，多次过滤洗涤，并定容至100 mL，取样液加入3,5-二硝基水杨酸溶液(DNS)并摇匀，沸水浴5 min，取出后立即放入凉水中冷却至室温，定容至25 mL，在540 nm波长下比色并记录。

1.2.1.8碳水化合物的测定

采用差值法，按下式计算：

碳水化合物(%)=100%-(水分+蛋白质+脂肪+灰分)%。

1.2.2豆豉挥发性成分鉴定

1.2.2.1顶空固相微萃取法(SPME)提取豆豉中风味物质

在顶空瓶底部加入1粒转子，称取5 g粉碎样品置于20 mL钳口瓶中，加入20 mL蒸馏水，用聚四氟乙烯隔垫密封,于磁力搅拌器上在60 ℃加热平衡15 min后,通过隔垫插入已活化好的SPME萃取头(270 ℃活化30 min),推出纤维头,顶空吸附40 min后,插入GC进样口解吸5 min。

1.2.2.2色谱条件和质谱条件

色谱条件：色谱柱为DB-5MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm；载气：氦气；柱流量：1 mL/min；进样口温度：250 ℃，不分流进样；起始温度40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升至150 ℃,再以10 ℃/min升至250 ℃，保持10 min。

质谱条件:接口温度280 ℃；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；离子化方式EI；电子能量70 eV，质量范围35～350 amu。

1.2.2.3化合物鉴定及定量

样品的挥发性化合物经气相色谱分离，不同组分形成其各自的色谱峰，用气相色谱-质谱(GC/MS)联用仪进行分析鉴定。分析结果运用计算机谱库(NIST/WILEY)进行初步检索及资料分析。

2　结果与分析

2.1　原料豆理化指标

表1　黑豆和黄豆的理化指标　%

由表1可知，黑豆的粗蛋白含量和粗灰分略高于黄豆，而黄豆的脂肪、水分和碳水化合物含量略高于黑豆。

2.2　SPME法分析豆豉中挥发性成分

表2　豆豉挥发性成分经SPME提取后的GC-MS分析结果

续　表

由表2可知，2种不同的豆豉样品经SPME方法、GC-MS分析后共检测出9类、65种挥发性化合物。其中黄豆豉检出酸类3种、醇类3种、酯类12种、醛类9种、酚类1种、杂环类3种、烃类6种、其他类1种，共38种挥发性化合物。黑豆豉检出酸类6种、醇类1种、酯类4种、醛类6种、酮类2种、酚类2种、杂环类4种、烃类9种、其他类2种，共36种挥发性化合物。2种豆豉中各类挥发性化合物所占比例见图1。

图1　经SPME法提取的2种豆豉挥发性成分的比较

由图1可知，黄豆豉中最主要的挥发性化合物是醛类，其次是醇类、酯类和烃类。而黑豆豉中最主要的挥发性物质也是醛类，但是酸类的百分含量在黑豆豉中也占了较大的比例。

经SPME法检测，黄豆豉所得到的挥发性成分相对百分含量较高的有苯乙醛(10.5608%)、2，3-丁二醇(6.0176%)、苯乙烯(4.9051%)、苯甲醛(4.588%)、乙酸(2.194%)、γ-壬内酯(1.9923%)、小茴香醛(1.8813%)、3-甲硫基丙醛(1.5833%)、乙基香兰素(1.5379%)、十四酸乙酯(1.3875%)、壬醛(1.158%)和γ-十一内酯(1.0658%)。

经SPME法检测，黑豆豉所得到的挥发性成分相对百分含量较高的有3-甲基丁酸(12.1981%)、苯乙醛(6.9729%)、反-2-庚烯醛(6.5372%)、D-柠檬烯(6.1124%)、苯甲醛(4.1037%)、庚烯酮(2.7924%)、反-2-辛烯醛(2.5627%)、2-甲基己酸(2.5563%)、辛烯酮(2.2062%)、2-甲基丁酸(1.6304%)和丁酸(1.6%)。

比较2种样品所检测出的结果，2种样品均有的挥发性物质只有丙酸、苯乙醇、十四酸乙酯、苯甲醛、苯乙醛、壬醛、癸醛、4-乙烯基愈创木酚和柠檬烯。经气相吸闻法分析，其中，苯乙醇具有特有的玫瑰花的香气；苯甲醛具有较浓重的苦杏仁气味和焦味；苯乙醛气味香甜，有玫瑰花香及些许发酵韵味；壬醛有类似玫瑰花的香气；丙醛具有类似甜香、柑橘香、蜡香、花香的气味，这些物质可能对豆豉的风味有一定影响。

经SPME检测，黄豆豉特有的挥发性化合物有γ-壬内酯、γ-十一内酯、小茴香醛和乙基香兰素等。其中，γ-壬内酯具有椰子型香气，略带茴香香韵，稀释后有杏、李子香气；γ-十一内酯又称桃醛，具有桃子、椰子、坚果、奶油、香子兰的气味；乙基香兰素具有类似香荚兰豆的香气，这些都可能对黄豆豉的风味做出贡献。而黑豆豉中特有的挥发性成分有1-辛烯-3-酮、1-庚烯-3-酮、反-2-庚烯醛和反-2-辛烯醛等。其中1-辛烯-3-酮具有蘑菇类气味；反-2-庚烯醛具有油脂香和果香；反-2-辛烯醛具有新鲜的黄瓜、清香的药草气息。

2.3　豆豉理化指标

经汪立军等[9]的研究，豆豉中的风味物质主要来源于大豆营养物质经微生物酶水解后生成的各种次级产物和小分子终产物。如蛋白质水解生成多肽、氨基酸，其中谷氨酸、天门冬氨酸具有鲜味，而酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等氧化后可生成黑色素；淀粉经酶水解生成糊精和麦芽糖，最终生成葡萄糖；葡萄糖经微生物酶水解又可生成乙醇、乙醛、乙酸、乳酸等多种小分子产物；而脂肪水解成甘油和脂肪酸，其中脂肪酸又是构成酯类的来源之一。这些次级产物和小分子物质有的本身具有香气，有的可以与其他物质作用生成色素、酯类等香气成分。

对2种豆豉理化指标进行的比较见表3。

表3　2种豆豉的理化指标

比较发现，黄豆豉的蛋白和氨基酸含量都高于黑豆豉，而黑豆豉的总酸和还原糖含量都高于黄豆豉。这些主要成分含量的差异可能是2种豆豉口味不同的原因之一。

3　结论

3.1　SPME法所得到的挥发性物质总结

采用固相微萃取方法对2种大豆豆豉进行鉴定，黄豆豉共鉴定出38种挥发性化合物，其中酸类3种、醇类3种、酯类12种、醛类9种、酚类1种、杂环类3种、烃类6种、其他类1种；黑豆豉共鉴定出37种挥发性化合物，其中酸类6种、醇类1种、酯类4种、醛类6种、酮类2种、酚类2种、杂环类4种、烃类10种、其他类2种。2种豆豉共同检出的豆豉主要香气成分有：苯乙醇、十四酸乙酯、苯甲醛、苯乙醛、壬醛、癸醛、4-乙烯基愈创木酚和柠檬烯。

3.2　2种豆豉特征风味物质总结

3.2.1黄豆豉中特征风味物质

丁内酯、γ-壬内酯、γ-十一内酯、丁酸丁酯、丁二酸二乙酯、香兰素、乙基香兰素、吲哚、吲哚嗪、香豆素等。

3.2.2黑豆豉中特征风味物质

5-辛内酯、1-辛烯-3-酮、1-庚烯-3-酮、反-2-庚烯醛、反-2-辛烯醛等。

可见2种豆豉具有不同的挥发性风味成分，2种豆豉的理化指标也有差异，这也是赋予2种豆豉不同感官风味的原因。

3.3　今后实验方向

实验室中常用的风味萃取方法有3种，一种是本文所用的SPME(顶空固相微萃取法)，此外还有同时蒸馏萃取(SDE)和固液萃取(S-L)法。在后面的实验中可以采用3种方法分别对黑豆豉和黄豆豉的挥发性风味成分进行测定，比较3种萃取方法的优劣，并根据结果选取更为合适的萃取方法。同时也可采用感官评定方法对2种豆豉的感官风味做评定。

参考文献：

[1]Liu Keshun．Soybean[M]．Maryland：Aspen Publishers,1999.

[2]朱红梅．豆豉的历史渊源与食用风习[J]．饮食文化研究，2004(1)：93-98.

[3]Yusuf Y,Romeo T．Major flavonoids in grape seeds and skins: antioxidant capacity of catechin,epicatechin,and gallic acid[J]．Journal of Agricultural and Food Chemistry,2004,52(2):255-260.

[4]李里特，张建华，李再贵，等．纳豆、天培与豆豉的比较[J]．中国调味品，2003(5)：3-7.

[5]町田忍．纳豆大全[M]．东京都：小学馆,1997.

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[7]蒋立文，周双都．曲霉型(浏阳)豆豉的现状和发展前景[J]．中国酿造，2003(9)：4-6.

[8]秦礼康，丁宵霖．传统陈窖豆豉粑和霉菌型豆豉挥发性风味化合物研究[J]．食品科学，2005，26(8)：275-280.

[9]汪立军．曲霉型豆豉发酵特性及风味物质研究[D]．北京：中国农业大学，2006.