正交实验法优选花椒多酚的超声波辅助提取工艺

李利华

(陕西理工大学 化学与环境科学学院，陕西 汉中　723000)

花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)，为芸香科花椒属植物，在我国大部分地区均有种植，其果皮为我国特有的食用香辛调料和中药材[1]。祖国医学认为[2]，花椒作为中药材，具有逐寒、行气、止痛、杀虫等功效，可以有效治疗胃脘冷痛、呕吐、腹泻、蛔虫等症，还可用作表皮麻醉剂。现代研究表明[3]：花椒中含有挥发油、生物碱、黄酮、多酚以及脂肪酸、酰胺类物质等多种活性成分，具有抑菌、镇痛、麻醉、抗氧化和抗癌等生物活性。目前，有关花椒中活性成分的研究已有相关的报道[4,5]，而关于花椒提取中多酚类物质的研究报道较少。

植物多酚(plant polyphenol)是一类广泛存在于植物体的根、木、果、叶、皮中的植物的次生代谢产物，属于芳香族羟基衍生物[6]。近年来已有研究证实[7,8]，植物多酚是一种天然的抗氧化剂，能够有效阻断人体脂质自氧化，清除体内过量自由基，延缓机体衰老等作用，是目前研究的热点。本研究采用超声波辅助法提取花椒中的多酚类化合物，先通过考察花椒多酚提取的4个主要影响因素：提取剂(乙醇)浓度、料液比、提取温度和提取时间对花椒多酚提取率的影响，再采用正交实验法优化花椒多酚的超声波辅助提取工艺参数条件，皆在为花椒多酚的开发利用提供一定理论依据。

1　实验材料与方法

1.1　材料与仪器

陕西红花椒：市售，经陕西理工大学生物系李新生教授鉴定为芸香科灌木花椒树的果实种皮。

没食子酸、福林-酚；试剂、无水碳酸钠、双氧水、石油醚等试剂：均为分析纯；实验用水：二次蒸馏水。

KQ-700VDE型三频式超声波处理器昆山超声仪器公司；UV型紫外-可见分光光度计日本岛津公司；TD-214型电子分析天平北京梅特勒仪器有限公司；中草药粉碎机河北宏博中药机械制造有限公司。

1.2　实验方法

1.2.1花椒多酚提取工艺流程

花椒果皮清洗→低温烘干至恒质量→粉碎→石油醚脱脂、脱色→挥发尽溶剂→乙醇浸提多酚→真空抽滤→测定提取液吸光度→真空干燥得花椒粗多酚。

1.2.2花椒多酚提取率的测定

采用福林-酚试剂显色法[9]，以没食子酸为标准对照品，于765 nm处测定吸光度值，以吸光度值(A)为纵坐标，多酚含量(C)为横坐标绘制标准曲线，得到标准曲线方程：A=0.8665C+0.1041，R2=0.9985。

精密吸取1.0 mL花椒多酚提取液于10 mL比色管中，依次加入1.0 mL福林-酚试剂和4 mL 15%Na2CO3溶液，以60%乙醇补足至刻线，室温避光反应2 h，利用紫外-可见分光光度计在波长765 nm下测定吸光度A，代入标准曲线方程计算多酚含量及提取率，每个样品做3份重复。

1.2.3单因素实验设计

以花椒多酚提取率为衡量指标，恒定超声波功率280 W，分别考察4个主要因素：乙醇浓度(40%，50%，60%，70%，80%)、料液比(1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60)、提取温度(40，50，60，70，80 ℃)和提取时间(30，45，60，75，90 min)对花椒中多酚类物质提取率的影响，每个处理做3份平行，选取各因素的适宜水平范围。

1.2.4正交实验设计

由单因素实验结果，利用L9(34)正交实验表[10]，优化花椒多酚的超声波辅助提取最佳工艺参数条件，因素水平表见表1。

表1　正交实验因素水平

1.2.5实验数据处理

使用Origin 8.0和SPSS 17.0处理数据并做图。

2　结果与分析

2.1　单因素实验结果分析

2.1.1乙醇浓度对花椒多酚提取效果的影响

图1　乙醇浓度对提取效果的影响

由图1可知，乙醇浓度在40%～60%范围内，多酚提取率随乙醇浓度的增大呈上升趋势，且在乙醇浓度为60%时提取率最高，为6.84%；而当乙醇浓度高于60%后，多酚提取率有所下降。这可能是浓度为60%的乙醇与花椒多酚的亲和能力最强，促使花椒多酚最大限度地溶出。因此，乙醇浓度选择60%左右为最佳浓度条件。

2.1.2料液比对花椒多酚提取效果的影响

图2　料液比对提取效果的影响

由图2可知，在料液比由1∶20增加到1∶30过程中，花椒多酚提取率迅速上升，说明适度增大提取剂的用量有利于原料和提取剂的充分接触，增加浓度的梯度差，从而提高其提取率；在料液比1∶30～1∶50过程中，花椒多酚提取率变化不大，且在料液比1∶40时提取率达最大值6.07%，之后提取率缓慢下降。这可能是多酚溶出已基本饱和，再增大提取剂用量会使其他杂质的溶出增多，影响多酚的提取率。因此选择料液比为1∶40左右。

2.1.3提取温度对花椒多酚提取效果的影响

图3　提取温度对提取效果的影响

由图3可知，在40～60 ℃范围内，花椒多酚的提取率随着提取温度的升高明显增加，提取温度为60 ℃时多酚提取率达最大值6.80%，之后提取温度继续升高，多酚提取率开始下降，80 ℃时多酚提取率仅为6.35%。这说明适度升温加快了分子的扩散速度，有利于花椒多酚的浸出；而提取温度过高一方面会引起乙醇溶剂的挥发，另一方面高温会使花椒中杂质的溶出量增加，导致花椒多酚提取率下降。因此，选择提取温度60 ℃左右。

2.1.4提取时间对花椒多酚提取效果的影响

图4　提取时间对提取效果的影响

由图4可知，随着提取时间的延长，花椒多酚的提取率呈现先上升后下降的趋势，在提取时间为60 min时花椒多酚提取率最高，为6.21%；提取时间超过60 min，花椒多酚提取率逐渐下降。这说明适当延长提取时间，有利于花椒多酚活性成分在溶剂中的充分扩散和溶出，而提取时间过长，会使溶液中已溶出的多酚物质分解，从而导致花椒多酚提取率的下降。因此，选用提取时间60 min左右。

2.2　正交实验设计结果分析

表2　正交实验设计及结果

表3　方差分析表

由表2可知， A(乙醇浓度)对花椒多酚的提取率影响最大，其次是C(提取温度)，B(料液比)对花椒多酚提取率影响最小，优化得到的最佳提取工艺条件为：A2B2C2D2，即：乙醇浓度60%，料液比1∶40，提取温度60 ℃，提取时间60 min。由表3方差分析可知，4个因素中A(乙醇浓度)对花椒多酚的提取率具有显著性影响，其他3个因素均无显著性影响。

2.3　验证实验

因利用L9(34)正交实验优化得到的花椒多酚最佳提取工艺条件与表2中的9组实验不重复，故通过验证实验考察该工艺条件的稳定性，在最佳工艺条件下(乙醇浓度60%，料液比1∶40，提取温度60 ℃，提取时间60 min)提取花椒多酚，并测定多酚提取率，制备3份平行试样，得到花椒多酚平均提取率为(7.05±0.03)%，高于正交实验设计中的9组多酚提取率

数值，表明该工艺条件比较稳定，可以作为花椒多酚超声波辅助提取的最佳工艺条件。

3　结论

本研究通过单因素实验和正交实验设计对花椒的超声波辅助提取工艺进行了优化。实验结果表明：乙醇浓度对花椒多酚的提取达到显著性水平，优化得到的最佳工艺条件为乙醇浓度60%，料液比1∶40，提取温度60 ℃，提取时间60 min。验证实验结果显示：在优化得到的最佳工艺条件下，花椒多酚提取率为(7.05±0.03)%，高于正交实验设计表中的数值，表明该工艺条件稳定，可以作为花椒多酚的超声波辅助提取工艺条件，为花椒多酚的工业化生产提供一定的数据参考，为花椒资源的进一步开发利用提供了理论依据。

参考文献：

[1]黄成就.中国植物志[M].北京:科学出版社,1997:8.

[2]张卫明,肖正春.中国辛香料植物资源开发利用[M].南京:东南大学出版社,2007:640.

[3]赵秀玲.花椒的化学成分、药理作用及其资源开发的研究进展[J].中国调味品,2012,37(3):1-5.

[4]郭静.花椒中有效成分的分析测定方法和抗氧化作用研究[D].重庆:西南大学,2008.

[5]Negi1 J S,Bisht V K,Bhandari A K,et al.Chemical constituents and biological activities of the genusZanthoxylum: a review[J].Afr J Pure Appl Chem,2011,5(12):412-416.

[6]石碧,狄莹.植物多酚[M].北京:科学出版社,2000:19-20.

[7]赵伟,李建科,何晓叶,等.几种常见植物多酚降血脂作用及机制研究进展[J].食品科学,2014,35(21):258-263.

[8]Irina V,Ioana I,Mariana N,et al.Thermal stability,antioxidant activity,and photo-oxidation of natural polyphenols[J].Chemical Papers,2017,68(1):121-129.

[9]李利华.鱼腥草多酚的超声波辅助提取及抗氧化性能研究[J].食品工业科技,2016,37(3):112-116.

[10]何为,薛卫东.优化实验设计:方法及数据分析[M].北京:化学工业出版社,2014:6-12.