骨碎补乙醇提取物对大鼠骨髓内皮祖细胞增殖的影响及机制

刘国岩，郝延科，李国弼，徐展望，徐琬梨

(1山东中医药大学附属医院，济南250014；2山东中医药大学)

传统中药骨碎补在促进骨折愈合及治疗骨质疏松症的临床应用中取得了很好的疗效。目前，骨碎补疗效机制的实验研究多集中于促成骨方面。血液供应是骨折愈合和成骨基础，内皮祖细胞(EPCs)具有促进血管修复及内皮再生的功能；而基质细胞衍生因子-1(SDF-1)是造血干细胞动员和归巢的关键因子，在细胞迁移、增殖、动员及血管形成等过程中起重要的作用。2016年9月～2017年7月，我们采用不同浓度骨碎补乙醇提取液培养大鼠EPCs，观察其对EPCs增殖及SDF-1表达的影响，从血管新生角度探讨骨碎补促进骨折愈合及治疗骨质疏松症的作用机制。

1　材料与方法

1.1　材料

6周龄SD大鼠40只，雌雄不限，体质量(180±20)g，购于山东大学实验动物中心。胎牛血清、DMEM培养基(美国Invitrogen公司)，EGM-2 MV Bulletkit培养基(LONZA)，小鼠单克隆抗体VEGFR-2、兔抗大鼠一抗CD34、CD133抗体(Abcam)，Ficoll淋巴细胞分离液(上海麦仓生物科技有限公司)，噻唑蓝(MTT，美国Novus公司)，中药骨碎补(山东中医药大学附属医院中药房提供)，胰蛋白酶及L-谷氨酰胺(Sigma)。倒置相差显微镜(日本Olympus公司)，荧光显微镜(美国Nikon公司)，图像分析系统(美国Image-Pro Plus)，低温高速离心机(Sigma，美国)，CO2细胞培养孵箱(美国Forma公司)。

1.2　骨碎补乙醇提取物的制备

将中药骨碎补600 g加入6 kg 75%乙醇中，回流提取2次，每次2 h。将2次提取液合并，减压回收乙醇，提取液浓缩至300 mL，骨碎补含量相当于2 g/mL，4 ℃保存。使用前在标准培养液中加入骨碎补乙醇提取物，分别配制成终浓度20、2、0.2 mg/mL的培养液。

1.3　大鼠EPCs的分离、培养与鉴定

向大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠处死，用75%乙醇浸泡30 min。无菌条件下分离双侧股骨并剔净肌肉及软组织，剪去骺端，DMEM培养液冲洗骨髓腔，收集冲洗液。加入淋巴细胞分离液，离心，收集细胞。加入EGM-2 MV Bulletkit培养基，重悬后接种包被纤维连接蛋白的培养瓶中，放置于5% CO2、饱和湿度条件的37 ℃孵箱培养。将原代贴壁细胞经体外诱导分化培养2周后的EPCs进行双荧光染色鉴定，以2.5 g/L胰酶+0.1 g/L EDTA消化传代至24孔板中，待细胞贴壁完全后，先后与CD133及FLK-1进行孵育1 h，在倒置荧光显微镜下观察。双荧光染色结果显示，EPCs呈CD133及FLK-1双阳性表达。

1.4　细胞分组与处理

取传代细胞，将细胞分为5组：①标准培养基组：加入标准培养液EGM-2 MV Bulletkit，含15%胎牛血清、VEGF 10 mg/L、青霉素100 μg/mL、链霉素100 μg/mL；②条件培养基组：标准培养液中加入地塞米松10-8mol/L、β-甘油磷酸钠10 mmol/L、VitC 50 μg/mL；③骨碎补高剂量组：标准培养液中加入20 mg/mL骨碎补乙醇提取液；④骨碎补中剂量组：标准培养液中加入2 mg/mL骨碎补乙醇提取液；⑤骨碎补低剂量组：标准培养液中加入0.2 g/mL骨碎补乙醇提取液。置37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

1.5　细胞形态观察

倒置相差显微镜下，每日观察EPCs生长、增殖及形态特征的变化并拍照。

1.6　细胞增殖能力观察

采用MTT法。向细胞中加入0.25%胰酶消化，体外增殖EPCs并计数，按200 μL/孔均匀接种到包被有明胶的96孔培养板，按1.4方法分组培养，待细胞贴壁后，分别于第1、3、5、7天每孔加10 μL MTT(5 mg/mL)，37 ℃、5% CO2培养箱继续培养4 h。弃上清液，加入二甲基亚砜，于微量振荡器充分振荡10 min，待结晶物充分溶解后，置酶标仪于波长490 nm处测OD值。

1.7　细胞SDF-1 mRNA表达检测

采用RT-PCR方法。将分组培养7 d后的细胞移去培养液，提取各组细胞总RNA，测定RNA浓度。根据Genbank检索大鼠SDF-1基因编码号NM_0010338277-96，347-370,片段长度249 bp。SDF-1上游引物5-ACGCCATGGACGCCAAGGTC-3′，下游引物5′-ACACCTCTCACATCTTGAGCCTCT-3′，扩增产物417 bp；β-actin上游引物5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′，下游引物5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′；扩增产物838 bp。扩增条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃延伸5 min。用凝胶图像分析系统分析结果，以SDF-1条带与β-actin条带灰度值的比值计算目的基因相对表达量。

1.8　统计学方法

2　结果

2.1　EPCs形态观察

各组原代分离出的单个核细胞呈体积较小的圆形，加入EGM-2 Bulletkit培养基后第2天细胞开始贴壁，呈类似于梭状形态的纺锤形，从第6天开始呈放射状向外周生长，第10天时呈微血管样生长。

2.2　各组细胞增殖能力比较

见表1。第1、3、5、7天标准培养基组、条件培养基组细胞OD值无统计学差异，骨碎补高、中、低剂量组OD值均高于标准培养基组和条件培养基组(P均<0.05)，骨碎补高、中、低剂量组之间OD值无统计学差异。

表1　各组细胞增殖能力比较

注：与标准培养基组、条件培养基组比较，*P<0.05，△P<0.01。

2.3　各组SDF-1 mRNA表达比较

标准培养基组、条件培养基组及骨碎补高、中、低剂量组SDF-1 mRNA相对表达量分别为1.010±0.029、1.088±0.028、1.154±0.021、1.389±0.019、1.125±0.031。标准培养基组、条件培养基组SDF-1 mRNA表达量低于骨碎补各剂量组(P均<0.01)，骨碎补中剂量组高于高、低剂量组(P均<0.05)。

3　讨论

中药骨碎补为骨伤科常用药物，具有补肾强骨、续伤止痛的作用。近年研究[1]显示，骨碎补能够通过促进Ⅰ型胶原及核心结合因子α1(Cbfα1)的表达，促进骨折愈合及防治原发性骨质疏松症。局部微血管生成是骨愈合的基础，特别是组织再生能力较差时或存在大范围骨缺损，通过促进血管形成来提高骨组织的再生与修复能力是非常重要的。目前，对于单味中药骨碎补的实验研究多聚集于促成骨方面，而关于调控相关促血管新生因子促进新生血管生成的研究较少。

血管EPCs是血管内皮细胞的前体细胞，具有游走性、自我更新及增殖分化的生物学特性，具有促进血管修复及内皮再生的功能，可以发育和分化为外周血细胞和血管壁细胞；同时具有特异性归巢的能力，以及增殖、分化、促进组织中新生血管形成的能力[2～4]。目前研究[5，6]已表明，激素、细胞因子、生长因子、促炎因子均可以动员调控血管EPCs增殖和迁移能力，增加新血管生成。当组织缺血时，血管EPCs和细胞因子均动员至缺损区域，继而分化成为成熟的血管内皮细胞，参与新生血管的形成[7，8]。Matsumoto等[9]分离培养外周血中的EPCs进行骨缺损修复，发现其可促进血管形成和骨形成，从而增强骨修复作用，使得EPCs在骨修复过程中的重要性得到证实。Yu等[10]研究发现，复合了EPCs的组织工程骨可通过有效的血管化促进成骨，同时防止骨坏死的发生。如何提高外周血循环中EPCs的数量及提高损伤处EPCs的浓度，成为最新研究热点。

SDF-1是造血干细胞动员和归巢的关键因子，在细胞迁移、增殖、动员及血管形成等过程中起重要作用[11～13]。SDF-1通过调节迟现抗原4表达，介导CD34细胞的黏附，在CD34细胞归巢至骨髓中发挥关键作用，并由此影响其在骨髓中的增殖和分化，使干细胞具有迁移归巢的特性。研究表明，SDF-1呈浓度依赖性促进EPCs增殖，并且显著增强EPCs的成血管能力。尹扬光等[14]利用密度梯度离心法获取并诱导小鼠骨髓EPCs，加入不同浓度SDF-1共培养48 h后，采用血清饥饿法和紫杉醇诱导EPCs凋亡，流式细胞仪和TUNEL法检测SDF-1对EPCs凋亡率的影响，发现SDF-1可以抑制EPCs凋亡。当组织发生损伤后，SDF-1水平上调并立即从损伤组织中释放，形成一定的SDF-1浓度梯度，使干细胞动员并迁移到损伤的组织。De Falco等[15]证实，在组织缺氧缺血早期，血浆SDF-1水平明显升高，提示在组织损伤后局部SDF-1升高动员及趋化EPCs开始修复受损组织。康庆林等[16]在大鼠骨髓源性EPCs的培养中，加入不同浓度SDF-1刺激，发现EPCs的迁移能力呈浓度依赖性增加，浓度越高作用越明显，由此提示SDF-1能促进骨髓源性EPCs迁移。目前，大多数学者倾向于EPCs迁移主要是受趋化因子家族及其受体的操控。

目前，中药调控对EPCs的作用研究主要围绕其数量、增殖、迁移和黏附功能。本研究采用中药骨碎补乙醇提取液培养大鼠EPCs，观察其增殖情况及细胞内SDF-1 mRNA表达水平的变化，探讨骨碎补对SDF-1表达的影响，从而进一步探讨骨碎补在促进骨愈合过程中是否具有促进新生血管生成作用。结果发现，不同浓度骨碎补乙醇提取液对EPCs均有促进增殖和促进SDF-1表达的作用，其中2 mg/mL骨碎补乙醇提取液促进大鼠EPCs增殖及加强SDF-1表达作用最显著。

综上所述，骨碎补乙醇提取液可以促进EPCs增殖，其机制可能与上调SDF-1表达有关。这为补肾强骨类中药在促进骨愈合过程中具有促进新生血管生成作用提供了理论依据。

参考文献：

[1] 刘国岩,徐展望,徐琬梨.骨碎补提取物对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化及Cbfα1表达的影响[J].山东医药,2013,53(25):16-18.

[2] Li WD, Li XQ. Endothelial progenitor cells accelerate the resolution of deep vein thrombosis[J]. Vascul Pharmacol, 2015,83:10-16.

[3] Sukmawati D, Tanaka R. Introduction to next generation of endothelial progenitor cell therapy: a promise in vascular medicine[J]. Am J Transl Res, 2015,7(3):411-421.

[4] Lee PS, Poh KK. Endothelial progenitor cells in cardiovascular diseases[J]. World J Stem Cells, 2014,6(3):355-366.

[5] Wojakowski W, Tendera M. Mobilization of bone marrow- derived progenitor cells in acute coronary syndromes[J]. Folia Histochem Cytobiol, 2005,43(4):229-232.

[6] Cignarella A, Fadini GP. Enhancing endothelial progenitor cell function through selective estrogen receptor modulation: a potential approach to cardiovascular risk reduction[J]. Cardiovasc Hematol Agents Med Chem, 2010,8(3):147-155.

[7] Balistreri CR, Buffa S, Pisano C, et al. Are endothelial progenitor cells the real solution for cardiovascular diseases focus on controversies and perspectives[J]. Biomed Res Int, 2015,2015:835934.

[8] Goligorsky MS. Endothelial progenitor cells: from senescence to rejuvenation[J]. Semin Nephrol, 2014,34(4):365-373.

[9] Matsumoto T, Kuroda R, Mifune Y, et al. Circulating endothelial/skeletal progenitor cells for bone regeneration and healing[J]. Bone, 2008,43(3):434-439.

[10] Yu H, Vandevord PJ, Gong W, et al. Promotion of osteogenesis in tissue-engineered bone by pre-seeding endothelial progenitor cells-derived endothelial cells[J]. J Orthop Res, 2008,26(8):1147-1152.

[11] Yamaguchi J, Kusano KF, Masuo O, et al. Stromal cell-derived factor-1 effects on ex vivo expanded endothelial progenitor cell recruitment for ischemic neovascularization[J]. Circulation, 2003,107:1322-1328.

[12] Segal MS, Shah R, Afzal A, et al. Nitric oxide cytoskeletal-induced alterations reverse the endothelial progenitor cell migratory defect associated with diabetes[J]. Diabetes, 2006,55:102-109.

[13] Nakamura Y, Ishikawa H, Kawai K, et al. Enhanced wound healing by topical administration of mesenchymal stem cells transfected with stromal cell-derived factor-1[J]. Biomaterials, 2013,34(37):9393-9400.

[14] 尹扬光,黄岚,赵晓辉,等.SDF-1对小鼠骨髓源性内皮祖细胞数量及功能影响[J].心血管康复医学杂志,2006,15(5):427-430.

[15] De Falco E, Porcelli D, Torella AR, et al. SDF-1 involvementin endothelial phenotype and ischemia-induced recruitment of bone marrow progenitor cells[J]. Blood, 2004,104(12):3472-3482.

[16] 康庆林,陆联松,陈佳.SDF-1/CXCR4生物轴活化诱导对鼠骨髓源性内皮祖细胞生物学性能的影响[J].解剖学研究,2012,33(6):413-416.