Foxp3在AOM/DSS诱导小鼠结肠癌模型中的表达及其意义

郭亚荣,柴　宝,刘近春,崔香丽

(1山西医科大学第一医院肿瘤科,太原　030001;2山西大医院消化科;3山西医科大学第一医院消化科;4山西医科大学生理学系;*通讯作者,E-mail:cuixlcxl@sina.com)

结肠癌是消化系常见的恶性肿瘤之一。近年来,结肠癌发病率及死亡率仍然持续升高[1]。结肠癌动物模型在临床前研究工作中发挥着重要的作用。其中,氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM)/葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate,DSS)小鼠模型是一种在致癌剂AOM和致炎剂DSS协同作用基础上,由炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)逐步发展为结直肠癌的炎症相关性癌症的研究模型。AOM/DSS模型能很好地模拟慢性肠道炎症诱发癌症的生理病理过程,近年来被广泛用于炎症相关性癌症形成机制的研究[2]。

结肠癌被认为是一种高免疫相关性疾病,其免疫功能一直受到广泛的关注。调节性T细胞(Treg细胞)是一类具有免疫抑制功能和免疫无能性的细胞群,可抑制自身免疫反应和机体对外来抗原或病原体的过度免疫反应。转录因子Foxp3[3]是Treg细胞最敏感的的特异性标志,对Treg细胞的活化及功能起着重要作用,其表达与Treg细胞密切相关。因此,本研究旨在观察AOM/DSS诱导小鼠结肠癌组织中Foxp3蛋白表达水平及探讨其意义。

1　材料与方法

1.1　实验动物及分组

6-8周龄雌性SPF级C57BL/6小鼠20只,体质量20-25 g,由北京市海淀兴旺动物养殖场提供,动物合格证号:SCXK(军)2012-0004。小鼠饲养于中国辐射研究院[许可证号:SYXK(晋)2013-0002],12 h昼夜交替的环境,食用标准的颗粒饲料以及饮用水。随机分为模型组和正常对照组,每组10只小鼠。

1.2　主要试剂与仪器

氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM)、葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate,DSS)均购自美国Sigma公司,4%多聚甲醛溶液(巴菲儿生物科技有限公司,批号:ASl018,ASl090),抗小鼠Foxp3抗体一抗(美国R&D公司,批号:MAB8214-SP,MAB421-100),兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phos-phate dehydrogenase,GADPH),抗体二抗(美国SantaCruz公司,批号:sc437853)。DYY-7C型电泳仪、DYCZ-24DN垂直电泳槽、DYCZ-40电转仪为北京六一仪器厂产品,迈瑞血细胞分析仪。

1.3　小鼠结肠癌模型的建立

雌性SPF级C57BL/6小鼠单剂量腹腔注射AOM(10 mg/kg),AOM配制成1 mg/ml,注射体积0.1 ml/10 g。注射后1周,给予1% DSS饮用7 d,之后给予正常水饮用14 d,为1个造模周期。共3个造模周期,之后正常饲养2周即实验11周末实验结束。

1.4　单核细胞检测

实验结束时,腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液(150 mg/kg)麻醉小鼠,行胸腔剖开,暴露小鼠心脏,心腔内取血1 ml,用于检测单核细胞数。所有实验小鼠留存新鲜血浆,按照试剂盒说明书(光学法)操作通过血细胞分析仪检测血细胞分析。

1.5　结直肠病理学观察

取小鼠距肛门10 cm肠管,观察其大致形态,取下段5 cm肠管以4%多聚甲醛固定2 d,常规石蜡包埋,切片,HE染色,光镜观察病理学变化。

1.6　免疫组织化学检测结肠组织Foxp3蛋白

结肠组织10%中性甲醛固定,石蜡包埋切片,厚度4 μm,载玻片为防脱片,用PBS按1 ∶1 500稀释一抗,按试剂盒操作说明进行免疫组化染色。

所有切片的观察经三名病理科医师独立在光镜下完成。每人均选择10个具有代表性的高倍视野(×400)倍,计数免疫组化标记定位准确的阳性细胞占肿瘤细胞的比例并记分,其标准为:胞浆阳性细胞数占肿瘤细胞数的10%以下为(±),10%-50%为(+),50%-80%为(++),80%以上为(+++),依次记为1，2，3，4分;染色强度依次以(±)、(+)、(++)表示,记为1,2,3分;计算两种得分的乘积。

1.7　统计学分析

2　结果

2.1　一般情况

模型组小鼠给予AOM/DSS处理第1个造模周期后出现竖毛,少动、食量下降,腹泻稀便,甚至黑便,肉眼可见暗红色血便,体质量下降;正常对照组小鼠给予正常饮水后无上述异常反应。

2.2　小鼠结肠组织病理学变化

正常对照组结肠黏膜上皮完整,固有层腺体排列规整,含丰富的杯状细胞,固有层有少量的淋巴细胞表达,黏膜下层、肌层、浆膜层结构清晰完整(见图1)。模型组肠黏膜弥漫性充血,黏膜上皮糜烂,黏膜及黏膜下层大量中性粒细胞及淋巴细胞浸润,固有层杯状细胞消失,腺体结构破坏,有溃疡形成,深至固有层,少数甚至出现非局限性透壁性坏死(见图1)。

图1　两组小鼠结肠组织HE染色结果Figure 1　Histological changes of colon tissues in AOD/DSS by HE staining

2.3　小鼠外周血中单核细胞计数

模型组小鼠外周血中单核细胞计数[(5.14±0.25)×109/L]较正常对照组[(5.78±0.17)×109/L]明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。

2.4　结肠组织Foxp3蛋白表达

正常组小鼠肠黏膜上皮、黏膜间质内淋巴细胞Foxp3蛋白鲜有表达;与正常组相比,模型组小鼠肠黏膜上皮细胞、腺上皮细胞Foxp3蛋白表达明显增多(见图2)。半定量分析结果显示,正常组和模型组间Foxp3蛋白表达差异有统计学意义(1.00±0.71vs3.55±0.88,P<0.05)。

图2　两组小鼠结肠组织中Foxp3的表达Figure 2　The expression of Foxp3 in colon tissue of mice by IHC

3　讨论

近年来我国结肠癌发病率逐年升高,其发病机制尚未完全阐明。肿瘤局部的免疫微环境.在结肠癌发生发展过程中起着至关重要的作用[4,5]。肿瘤局部的免疫反应一方面可以激活细胞毒性淋巴细胞,从而起到杀灭肿瘤细胞的效果；另一方面,肿瘤局部持续的慢性炎性反应,可加速肿瘤的生长、浸润甚至远处转移[6]。肿瘤相关免疫逃逸已在多项研究中得到证实,调节性T细胞的免疫无能及免疫抑制等特点使其在肿瘤的免疫逃逸机制中起重大作用,肝癌[7]、肺癌[8]、膀胱癌[9]等Treg细胞增高为其提供了一定的理论依据。研究表明Foxp3是Treg细胞特征性表面分子,可通过调控多种基因来调节该细胞的活性[10]。本实验通过免疫组化染色检测Foxp3蛋白表达来反应Treg细胞的生物活性,结果表明AOM/DSS诱导小鼠结肠癌组织中Foxp3的表达高于正常对照组结肠组织,推测Treg细胞不但数量增加,而且其功能也可能增强,进而促进肿瘤免疫耐受的形成,对结肠癌患者的机体产生一定的免疫抑制作用,促进肿瘤的发生和发展。

单核细胞是机体防御系统的一个重要组成部分,目前认为它是巨噬细胞的前身,具有吞噬和清除衰老、受伤细胞及碎片的功能。据报道,升高的术前外周血单核细胞计数与结直肠癌肝转移相关,可能通过使肿瘤患者处于免疫抑制状态促进了结直肠癌肝转移[11]。本研究结果提示,结肠癌动物模型外周血中单核细胞计数较正常对照组明显降低,表明结肠癌发生可能与其免疫功能抑制有关,而单核细胞在其中发挥着一定的作用。

本研究结果提示:Treg细胞免疫及单核细胞在AOM/DSS诱导小鼠结直肠癌发生发展过程中发挥着重要作用。

参考文献：

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[11]胡时栋,邹振玉,李浩,等.外周血单核细胞计数与结直肠癌肝转移的关系[J].中国临床研究,2016,29(1):17-19.