CD82抑制口腔鳞癌细胞OSCC-15裸鼠移植瘤生长的研究

柴　娟,孙沫逸,刘昌奎,李海燕,刘　宁,黄　硕

(1西安医学院口腔系口腔颌面外科教研室,西安　710021;2第四军医大学口腔医院口腔颌面外科;3西安医学院医学技术系;*通讯作者,E-mail:chaijuan82@126.com)

头颈癌是世界常见恶性肿瘤之一,它包括唇癌、口腔癌、鼻腔癌、鼻窦癌、咽喉癌等[1]。其中口腔癌的发病率在全球呈逐年上升趋势[2]。CD82是TM4SF蛋白家族中的主要成员之一,最先是在Dunning家兔前列腺癌模型中发现的抑癌基因[3]。本团队前期工作观察到,在体外细胞实验中过表达CD82可以有效抑制口腔癌细胞的增殖、侵袭能力和促进肿瘤细胞凋亡。本次研究采用人口腔鳞癌裸鼠移植瘤模型,观察CD82对人口腔鳞癌裸鼠移植瘤生长的影响,为探讨其在口腔鳞癌作用提供体内动物实验基础。

1　材料和方法

1.1　实验动物、细胞株和质粒

5周龄雄性BALB/c裸鼠,体质量18-22 g,购自北京维通利华公司,生产许可证SCXK(京)2012-0001,第四军医大学动物实验中心SPF级动物室饲养。口腔鳞癌OSCC-15细胞购于美国菌种保藏中心ATCC,真核表达质粒pIRES2-EGFP-CD82由第四军医大学口腔颌面创伤实验室所保存。

1.2　主要试剂及仪器

胎牛血清购自美国Sigma公司,DMEM培养基购自英国Oxoid,FBS购自美国Invitrogen公司,胰蛋白酶购自北京鼎国昌盛生物有限公司(27025-H-8),Ki67抗体(Dako,丹麦),PCNA抗体(Abcam,美国),鼠兔通用免疫组化二抗试剂盒(上海基因科技)。AE31型显微镜购自国产Motic。免疫组化试剂盒(KIT-5020)购自国产福州迈新生物公司。

1.3　口腔癌裸鼠移植瘤模型的建立

体外培养三组细胞,人口腔鳞癌OSCC-15细胞为空白对照组;转染空白质粒载体的OSCC-15细胞为阴性对照组;转染pIRES2-EGFP-CD82过表达载体的OSCC-15细胞为实验组。将处于对数生长期的三组细胞各0.2 ml(1×106/ml)混悬液接种于裸鼠右前肢皮下,建立裸鼠移植瘤模型。每组接种6只,接种后第3天开始观察瘤体大小,直至25 d后采用脱颈法处死裸鼠,并完整取出瘤体,称其质量。用游标卡尺测量肿瘤的最长径a(mm)和最短径b(mm)。计算肿瘤体积(V=a×b2×0.52)、瘤体积抑制率=(V正常对照组-V实验组)/V正常对照组×100%。

1.4　免疫组化检测Ki67及PCNA

常规石蜡移植瘤标本,每个标本连续切片30张(4 μm/张),脱蜡、水化处理后,1×PBS缓冲液洗涤,高压修复抗原、1×PBS缓冲液洗涤再次清洗、3%过氧化氢滴加在组织切片、10%山羊血清封闭且甩去多余液体。再分别加入50 μl一抗稀释度为1 ∶300的Ki67和1 ∶200的PCNA,置于湿盒内,4 ℃过夜,防止切片干燥。1×PBS缓冲液漂洗后,加复合二抗酶标抗鼠/兔聚合物(Polymerized HRP-Anti Ms/RbIgG),3×PBS缓冲液漂洗后,DAB显色,在显微镜下掌握染色程度约4 min。苏木素复染、1%盐酸酒精分化。脱水、封片,光镜观察。结果判定:阳性表达为细胞核染成黄色或棕黄色(显微镜400倍下计数,连续5个视野内的阳性细胞个数)。

1.5　统计学分析

IPP 6.0软件计数免疫组化的阳性细胞数,采用SPSS19.0软件(IBM SPSS,Armonk,NY,USA)进行统计学记录,采用单因素方差分析进行统计学分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1　口腔癌细胞OSCC-25中CD82的高表达

在转染后72 h CD82免疫荧光镜下可以观察到超过90%的OSCC-25细胞中有CD82的表达(见图1)。

图1　转染后72 h口腔癌细胞OSCC-25中CD82的表达Figure 1　Expression of CD82 in OSCC-25 cells after transfection with CD82 for 72 h

2.2　CD82对移植瘤在裸鼠体内生长的影响

细胞接种于裸鼠右前肢皮下第7天所有裸鼠观察到米粒大的移植瘤,呈结节性生长,成瘤率为100%。接种后25 d完整后取出瘤体,实验过程中无一例裸鼠死亡。所取移植瘤形态见图2。空白对照组、阴性对照组及实验组移植瘤体质量分别为(0.87±0.21)g,(0.81±0.29)g,(0.44±0.37)g,阴性对照组和实验组肿瘤抑制率分别为(17.28±5.21)%,(77.21±3.25)%,实验组有效抑制了肿瘤增长,且差异有统计学意义(P<0.05,见图3)。

图2　不同组别6只裸鼠移植瘤体积形态Figure 2　The xenograft shape of tumors from different groups

与空白组和阴性对照组比较,*P<0.05图3　各组裸鼠移植瘤体积随时间变化的生长曲线Figure 3　The growth curve of xenograft at different time points

2.3　CD82对裸鼠全身一般状态的影响

实验期间,空白组、阴性对照组及实验组动物进食饮水、活动正常,反应敏捷,精神状态均良好。用药前各组裸鼠体质量差异无统计学意义(P>0.05),实验结束后,各组裸鼠体质量亦无统计学差异(P>0.05,见表1)。

2.4　裸鼠移植瘤内Ki67的表达

免疫组化结果显示,Ki67在各组移植瘤内均有表达(见图4)。空白对照组、阴性对照组及实验组每视野分别为522.23±101.17,538.36±105.72,348.51±117.09个。实验组Ki67的表达量较空白组和阴性对照组下降明显,且差异有统计学意义(P<0.01)。

组别n实验前实验后空白组 618.75±2.5525.25±1.62阴性对照组618.76±2.7124.75±0.96实验组 618.87±2.6224.92±0.73

2.5　裸鼠移植瘤内PCNA的表达

免疫组化结果显示,PCNA在各组移植瘤内均有表达(见图5)。空白对照组、阴性对照组及实验组每视野分别为542.12±201.25,558.33±205.22,288.18±136.05个。实验组PCNA的表达量较空白组和阴性对照组下降有明显差异(P<0.01)。

3　讨论

CD82基因也被称为KAI1基因、R2抗原、C33、IA4、4F9。很多学者发现并证实,CD82与多种组织肿瘤细胞的发生发展有相关性[4-7]。裸鼠是在近十几年中发展起来的动物模型,因其先天性胸腺发育不良,而导致TB淋巴免疫细胞缺陷。另外它具有使移植瘤体容易成活的特点,所以也常常成为目前肿瘤学和免疫学研究所需要的动物模型之一。

图4　各组裸鼠移植瘤Ki67免疫组化染色 (×400)Figure 4　The expression of Ki67 in xenograft by immunohistochemistry (×400)

图5　各组裸鼠移植瘤PCNA免疫组化染色 (×400)Figure 5　The expression of PCNA in xenograft by immunohistochemistry (×400)

已有研究证实,CD82基因在很多组织裸鼠移植瘤模型中有抑制作用。Liu等[8]将过表达CD82基因转染于胰腺癌MIA PaCa-2细胞系后,注射于裸鼠皮下。通过观察裸鼠体内的肿瘤生长曲线及免疫组化切片,发现CD82能抑制胰腺癌肿瘤的生长及其肿瘤淋巴结的转移。Tang等[6,9]通过体内裸鼠模型实验证实,过表达CD82能够抑制人的黑色素瘤体内血管的形成,而沉默CD82后瘤体内血管有显著增加。但国内外尚无报道过表达CD82会对口腔鳞状细胞裸鼠移植瘤的生长有怎样的影响。本实验在体外细胞研究水平基础上,通过将CD82基因转染于口腔鳞癌细胞OSCC-15后注射于裸鼠皮下,观察裸鼠瘤体的体积生长曲线及肿瘤抑制率。实验中与空白对照组和阴性对照组相比较发现,CD82转染组对口腔鳞状细胞裸鼠抑制瘤生长有明显抑制作用。这与学者[6-9]关于CD82在其他组织的裸鼠移植瘤模型中作用的研究结果是相一致的。

本次实验期间,18只裸鼠模型均在注射后第7天观察到开始成瘤,成瘤率为100%。动物生长环境均为SPF级别,实验操作严格按照动物实验相关规定进行。至实验结束,三组裸鼠动物精神、饮食、活动等方面均无明显异常,体质量持续增加,但无统计学差异。说明CD82对裸鼠无明显的毒性作用。

Ki67抗原是近年来反映细胞增殖活性的蛋白标记[10,11],与细胞有丝分裂密切相关,在细胞增殖周期G1、S、G2、M期的细胞着色。国内外很多学者发现Ki67与口腔鳞状细胞癌异常增生有关[12-15]。PCNA在细胞增殖的启动上起重要作用,可用于评估肿瘤的恶性程度及增殖潜能。很多学者发现PCNA在口腔鳞癌中呈异常表达[16,17]。本研究结果显示,CD82实验组与空白组、阴性对照组相比,Ki67、PCNA的表达明显降低(P<0.01),说明CD82具有明显抑制口腔鳞癌细胞增殖的作用。

实验结果表明CD82能够抑制OSCC-15细胞裸鼠移植瘤的生长,对裸鼠全身并无明显毒性作用。其确切机制有待在以后的研究中进一步探讨,以期为CD82治疗口腔鳞癌提供更多的理论依据。

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