基于生物信息学方法对抑郁小鼠长期服用氟西汀后差异基因表达的分析

高丽娟,李建国,赵　欣,徐　勇,杨　姣,张　宇*

(1山西医科大学生理学系,太原　030001;2山西医科大学细胞生理学教育部重点实验室;3山西医科大学第一医院精神科;4山西医科大学基础医学院解剖教研室;*通讯作者,E-mail:zhyucnm@163.com)

抑郁症是情感性精神障碍综合征,以显著而持久的心境低落、认知功能损伤、思维迟缓、意志活动减退等症状为主要临床特征的一类心境障碍。随着社会的飞速发展和生活节奏的加速,人们所承受的心理压力越来越大,抑郁症患病率也随之呈逐年上升趋势[1]。对抑郁症的治疗,氟西汀(fluoxetine)是最常用的抗抑郁药之一[2],该药通过提高血清中5-羟色胺的浓度促进海马神经元的增殖和存活达到治疗效果。然而该药副作用比较多,对该药治疗效果的评价多通过临床表现和量表等方式为依据[3],这些方法不仅周期较长而且可信度存在差异,因此有必要尝试周期短、省时省力、定位准确的新方法。

基因芯片是一种基于高通量测序的方法,从基因水平对疾病进行深度分析和研究。本文通过利用GEO公共数据库中的资源,首次对长期服用氟西汀抑郁小鼠海马部位的基因表达情况进行了生物信息学分析,从基因水平揭示抗抑郁药的影响,为抑郁症个体的用药合理性及用药指导提供了有力证据。

1　材料和方法

1.1　主要材料

美国国立生物技术信息中心NCBI(National Center for Biotechnology Information:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站的基因表达综合数据库GEO(Gene Expression Omnibus:https://www.ncbi.nlm.nihgov/geo/)是当前规模最大、收录最全、免费开放的公共基因表达数据库,本文以此为数据源,设定“fluoxetine”为关键检词,获得GSE6476系列数据,该数据中包括2个对照组和2个给药组,对照组登录号为GSM148900、GSM148901,给药组登录号为GSM148902、GSM148903。对照组为DBA/2J雄性抑郁小鼠,给药组为DBA/2J雄性抑郁小鼠治疗组,该组小鼠通过主动饮用加有氟西汀药物的水,从而得到治疗,并结合悬尾试验对抑郁效果进行验证,取小鼠海马组织进行测序,本文对该芯片测序数据进行深入分析。

1.2　样本分析的主要方法

本文数据分析和作图主要采用R语言与Bioconductor以及网络分析软件。其中,R语言是一种用来进行数据探索、统计分析和作图的解释型语言,在统计分析、生物学等领域有着广泛的应用。

1.3　样本的主成分分析

主成分分析(PCA)可将一个多变量的复杂问题简化为低维空间的简单问题。本文使用R语言自带函数“prcomp”对差异基因进行主成分分析,从而使复杂数据简单化,方便进一步分析。

1.4　差异基因的筛选

Bioconductor是基于R语言开发的面向基因组生物信息分析的应用软件集合,它提供的各种基因组数据分析和注释工具主要针对DNA微阵列或基因芯片数据的处理、分析、注释及可视化。本文采用R语言与Bioconductor中“limma”包筛选差异基因,设定logFC>1,P<0.05为条件,并用聚类图和火山图展示结果。

1.5　差异基因的GO功能富集分析

采用The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery(DAVID)在线基因注释软件(https://david.ncifcrf.gov/)选取Gene Ontology(GO)数据库对差异基因进行功能富集分析,从生物过程(biological process,BP),细胞组成(cellular component, CC),分子功能(molecular function, MF)三个方面对基因涉及的功能进行注释、富集和聚类,定位差异基因最可能涉及到的过程,从而分析差异基因所涉及的生物学过程、细胞组成以及分子功能方面上的差异和变化。

1.6　差异基因的Pathway生物学通路分析

本研究采用KEGG在线软件(http://www.kegg.jp/)对差异基因进行Pathway通路分析。在生物体内,不同基因相互协调行使其生物学功能,基于Pathway的分析有助于更进一步了解基因的生物学功能。

1.7　差异基因所编码蛋白之间相互作用分析

STRING数据库(https://string-db.org/)是一个常用来验证已知蛋白质和预测蛋白质之间相互作用的软件系统,本研究采用STRING在线数据库绘制靶基因编码蛋白互作网络图,预测涉及抑郁症用药相关的核心基因。并结合Universal Protein Resource(Uniprot)网站查询基因的功能和作用。

2　结果

2.1　样本的主成分分析结果

本研究采用R语言自带函数包“prcomp”对差异基因进行主成分分析,使高通量数据降维成为简化的数据,取贡献率最大的前三个主成分PCA1,PCA2,PCA3进一步分析,可以看出样品间互不相干(见图1),有利于提取两类样品的特征信息进行下一步分析。

2.2　差异基因的筛选结果

通过R语言和Bioconductor的分析,获得144个差异基因,其中上调基因111个,下调基因33个(见图2,3)。选取前50个差异基因构建分层聚类图,图中的4个列表示样本,其中前两列代表对照组,后两列代表给药组,各行表示差异基因的表达情况(见图3)。

con为对照组;sam为给药组;PC1、PC2、PC3分别表示3个主成分图1　差异基因的主成分分析图Figure 1　Principal component analysis of differentially expressed genes

红点表示上调基因,绿点表示下调基因;adj.P.Val是矫正后的P值图2　差异基因的火山图Figure 2　Volcano plot of the differentially expressed genes

图3　差异基因的分层聚类图Figure 3　Hierachical clustering of the differentially expressed genes

2.3　差异基因的GO功能富集分析结果

通过DAVID在线软件对差异表达基因进行GO分析,发现差异基因主要分布在胞外区(GO:0005576)、胞外空隙(GO:0005615)、细胞外基质(GO:0031012)、基膜(GO:0005604)、细胞表面(GO:0009986)、女性妊娠(GO:0007565)、树突(GO:0030425)、胶原原纤维组织(GO:0030199)、钙离子结合(GO:0005509)、神经肽信号通路(GO:0007218)、细胞质核周区(GO:0048471)、细胞因子应答(GO:0034097)等过程(见表1)。另外,GO分析发现这些差异基因(P<0.005)参与生物过程有14个,参与细胞成分有16个,参与分子功能有9个(见图4)。

参与生物过程(绿色部分),细胞成分(蓝色部分),分子功能(紫色部分)(P<0.005)图4　GO功能富集分析差异基因Figure 4　The result of gene ontology(GO) function analysis of differentially expressed genes

2.4　差异基因的Pathway生物学通路分析结果

通过R语言与Bioconductor的“stringi”包获得8个Pathway通路(见图5),经分析发现差异表达基因主要集中在甘油酯代谢、N-聚糖的生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢途径、花生四烯酸代谢、甘油磷脂代谢、氧化磷酸化等通路中。

2.5　差异基因所编码蛋白的相互作用结果

经STRING在线软件分析筛选出78个差异表达基因所编码的蛋白产物存在相互作用(见图6,7)。图6和图7为前30个差异表达基因构建互作网络,并筛选到Vim、Bdnf、Npy、Gfap、Penk、Fosb、Cd44、Timp1、Lgals1等核心基因(logFC>1,节点数>5)。

表1差异基因GO功能富集分析,包括生物过程,细胞成分,分子功能

Table1Geneontology(GO)Functionanalysisofdifferentiallyexpressedgenesinvolvedinbiologicalprocess,cellularcomponentandmolecularfunction

分类GO术语 描述富集基因数P生物过程GO:0007565女性妊娠70.00003生物过程GO:0010628正调控基因表达120.00016生物过程GO:0030199胶原原纤维组织50.00018生物过程GO:0007218神经肽信号通路60.00023生物过程GO:0034097细胞因子应答60.00031生物过程GO:0045185蛋白定位的维持30.00031生物过程GO:0007155细胞粘附120.00081生物过程GO:0042493药物应答100.00082生物过程GO:0007268化学突触传递70.00159生物过程GO:0007568老化70.00164生物过程GO:0007631摄食行为40.00189生物过程GO:0001662恐惧反应40.00347生物过程GO:0021675神经发育30.00386生物过程GO:0042060伤口愈合50.00485细胞成分GO:0005576胞外区430细胞成分GO:0005615胞外空隙340细胞成分GO:0005578细胞外基质蛋白160细胞成分GO:0031012细胞外基质150细胞成分GO:0005604基膜80细胞成分GO:0009986细胞表面170细胞成分GO:0070062外泌体360细胞成分GO:0030425树突130.00013细胞成分GO:0048471细胞质核周区150.00025细胞成分GO:0043025神经元胞体120.00102细胞成分GO:0005886质膜500.00129细胞成分GO:0009897质膜外侧90.00143细胞成分GO:0072562血液微粒60.00211细胞成分GO:0016323质膜基底外侧70.00260细胞成分GO:0030424轴突90.00372细胞成分GO:0005887质膜整体170.00391分子功能GO:0005509钙离子结合160.00022分子功能GO:0005515蛋白结合490.00037分子功能GO:0043236层粘连蛋白结合40.00093分子功能GO:0005102受体结合110.00104分子功能GO:0001968纤连蛋白结合40.00128分子功能GO:0005184神经肽活性40.00128分子功能GO:0048306钙依赖蛋白结合50.00175分子功能GO:0019838生长因子结合40.00375分子功能GO:0008083生长因子活性60.00462

从红色到蓝色,颜色越蓝,表示富集程度越高,横轴代表富集基因数,纵坐标代表通路术语图5　差异基因的Pathway通路分析Figure 5　Pathway analysis of differentially expressed genes

3　讨论

本研究经过R语言与Bioconductor处理数据,结合DAVID、STRING、Uniprot等生物信息学方法对长期服用氟西汀的抑郁小鼠海马基因表达情况进行了深入分析,从基因水平揭示长期服用抗抑郁药对机体的影响,最后得到Vim[4]、Bdnf[5]、Npy、Gfap[6]、Penk、Fosb[7]、Cd44[8]、Timp1、Lgals1等核心基因,这些基因在神经肽通路、女性生育、突触传递、神经发育等过程中扮演了重要的角色。其中,脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,Bdnf)与抑郁症之间的关系已有比较多的研究,Bdnf在神经系统的发育过程中对神经元的存活、分化和生长发育起着重要的作用,能改善神经元的病理状态、增加突触可塑性、促使受伤的神经元再生和修复[9],从而使抑郁症达到一定的治疗效果。Taliaz等[10]曾利用慢病毒载体和RNA干扰技术直接作用于海马区,使齿状回中Bdnf表达量下降,减少了海马体神经元分化,影响抑郁行为,从而证明Bdnf和抑郁症的发生机制有直接关系,本文结论与此一致。

图6　差异基因表达蛋白互相作用网络图(节点数>5)Figure 6　Differentially expressed genes in the protein interactive network (count>5)

图7　78个差异基因的蛋白互相作用网络图Figure 7　Protein interaction network of 78 differentially expressed genes

本文筛选到的核心基因不仅是抑郁症治疗的相关基因,同时与疼痛[11]、炎症[12]、认知[13]、癫痫、精神分裂症[14]等疾病也有密切联系。经文献报道,这些疾病大都是抑郁症的共患病,并且本文筛选到的核心基因在以上病症中也有作用,比如Penk、Npy等基因在疼痛反应中有重要的作用,其中,脑啡肽原(proenkephalin-A,Penk)是神经递质的一种,被称作“脑内吗啡”,能够模拟阿片药物的作用在神经系统中执行重要的生理功能,其Penk(114-133)片段和Penk(237-258)片段能够促进纹状体谷氨酸的释放,从而对疼痛进行调节;而神经肽Y(pro-neuropeptide Y,Npy)对突触前神经末端的谷氨酸释放也有调节作用[15],从而对疼痛有一定的作用。另外,Li等[11]通过对外侧缰核处的放电频率及c-Fos表达情况研究发现抑郁和疼痛总是相伴发生的,并证明抑郁症和疼痛的发病机制之间有着密切的联系,可见疼痛和抑郁的共患关系。

然而,抑郁症的发病机制非常复杂,其具体发病机制目前尚不完全清楚,一般认为与遗传、性别、神经内分泌[16]、免疫[17]、心理社会环境[18]以及肠道微生物[19]等因素有关。近几年,单胺类递质假说被科研人员普遍认可,该理论认为抑郁症的发生主要是由突触间单胺类递质(如5-羟色胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺等)异常引起的,有文献报道,本文筛选到的关键基因Vim基因可与5-羟色胺转运体C端结合,进而影响5-TH含量[20],为氟西汀治疗抑郁症增加了理论后盾。另外,炎性免疫假说也越来越受到重视,该假说认为抑郁症是一种心理-神经-免疫紊乱性疾病,免疫功能在抑郁症的治疗中起到了比较重要的作用[21]。林文娟等[22]采用中枢炎性免疫应答造模,补充外源性成纤维细胞生长因子2(FGF2)调节和提高细胞外信号调节激酶(ERK)信号分子的水平的方法,改善了炎性免疫导致的神经发生抑制,逆转了中枢炎性免疫所引起的抑郁样行为,这一研究为抑郁症的发生机制增添了新的理论依据。除此之外,还有学者提出肠道微生物与抑郁症的关系,该理论认为长期处于压力状态下而抑郁的小鼠,其肠道微生物的组成和代谢特征也会发生显著变化[23]。另外,药物在机体内的代谢也会影响肠道微生物的功能,药物在机体内不仅会诱导肝损伤,胆汁中排泄的药物代谢物还会被肠道细菌重新变成药物并被肠道再次吸收,即“增强型肠肝循环”的过程,与此同时,肠道菌群发生特定的丰度变化[24],进而影响疾病的发生,这是一条非常重要但是经常被忽视的途径,对该过程的发现和了解将有助于开发新的治疗策略。也有研究人员认为,肠道微生物对神经系统的作用是以免疫系统为重要调节者来协调中枢神经生理功能和行为方面的相互作用[25],进而推测中枢神经系统、免疫系统和肠道微生物之间的密切关系。

综上所述,影响抑郁行为的机制和原因错综复杂,本文筛选到的核心基因有可能作为治疗抑郁症、评估治疗效果以及预测抗抑郁症药物副作用的潜在靶点基因,本文分析结果也为进一步的实验研究提供了重要的线索和参考信息。

参考文献：

[1]Whiteford HA, Degenhardt L, Rehm J,etal. Global burden of disease attributable to mental and substance use disorders: findings from the Global Burden of Disease Study 2010[J]. Lancet, 2013, 382(9904): 1575-1586.

[2]Kitahara Y, Ohta K, Hasuo H,etal. Chronic fluoxetine induces the enlargement of perforant path-granule cell synapses in the mouse dentate gyrus[J]. PloS one, 2016, 11(1): e0147307.

[3]苑杰,严辞,刘昊,等.抑郁症生物标志物研究进展[J].国际精神病学杂志,2015,42(2):103-107.

[4]Liu Z, Li Y, Cui Y,etal. Beneficial effects of gfap/vimentin reactive astrocytes for axonal remodeling and motor behavioral recovery in mice after stroke[J]. Glia, 2014, 62(12): 2022-2033.

[5]Su CL, Su CW, Hsiao YH,etal. Epigenetic regulation of BDNF in the learned helplessness-induced animal model of depression[J]. J Psychiatr Res, 2016, 76(1): 101-110.

[6]Cobb JA, O’Neill K, Milner J,etal. Density of GFAP-immunoreactive astrocytes is decreased in left hippocampi in major depressive disorder[J]. Neuroscience, 2016, 316: 209.

[7]Vialou V, Thibault M, Kaska S,etal. Differential induction of FosB isoforms throughout the brain by fluoxetine and chronic stress[J]. Neuropharmacology, 2015, 99: 28-37.

[8]Vinci L,Ravarino A,Fanos V,etal.Immunohistochemical Markers of Neural Progenitor Cells in the Early Embryonic Human Cerebral Cortex[J]. Eur J Histochem, 2016, 60(1):2563.

[9]Xu J, Liu Y, Wang P,etal. Positive association between the brain-derived neurotrophic factor (BDNF) gene and bipolar disorder in the Han Chinese population[J]. Am J Med Genet B, 2010, 153B(1): 275-279.

[10]Taliaz D, Stall N, Dar DE,etal. Knockdown of brain-derived neurotrophic factor in specific brain sites precipitates behaviors associated with depression and reduces neurogenesis[J]. Mol Psychiatr, 2010, 15(1): 80-92.

[11]Li J, Yang L, Zhang B,etal. Why depression and pain often coexist and mutually reinforce: Role of the lateral habenula[J]. Exp Neurol, 2016, 284(Pt A): 106-113.

[12]Gonçalves FM, Freitas AE, Peres TV,etal. Vatairea macrocarpa lectin (VML) induces depressive-like behavior and expression of neuroinflammatory markers in mice[J]. Neurochem Res, 2013, 38(11): 2375-2384.

[13]Travis S, Coupland NJ, Silversone PH,etal. Dentate gyrus volume and memory performance in major depressive disorder[J]. J. Affect. Disorders, 2015, 172: 159-164.

[14]Gunduz-Bruce H, Kenney J, Changlani S,etal. A translational approach for NMDA receptor profiling as a vulnerability biomarker for depression and schizophrenia[J]. Exp Physiol, 2017, 102(5): 587-597.

[15]Meurs A, Portelli J, Clinckers R,etal. Neuropeptide Y increases in vivo hippocampal extracellular glutamate levels through Y 1 receptor activation[J]. Neurosci Lett, 2012, 510(2): 143.

[16]Oglodek E, Szota A, Just M,etal. The role of the neuroendocrine and immune systems in the pathogenesis of depression[J]. Pharmacol Res, 2014, 66(5): 776-781.

[17]Tang MM, Lin WJ, Pan YQ,etal. Hippocampal neurogenesis dysfunction linked to depressive-like behaviors in a neuroinflammation induced model of depression[J]. Physiol Behav, 2016, 161: 166-173.

[18]Weightman MJ, Air TM, Baune BT. A review of the role of social cognition in major depressive disorder[J]. Front Psychiatry, 2014, 5: 179.

[19]Messaoudi M, Lalonde R, Violle N,etal. Assessment of psychotropic-like properties of a probiotic fomulation (Lactobacillus helveticus R0052 and Bifidobacterium longum R0175) in rats and human subjects[J]. Brit J Nutr, 2010, 105(5): 755-764.

[20]Ahmed BA, Bukhari IA, Jeffus BC,etal. The cellular distribution of serotonin transporter is impeded on serotonin-altered vimentin network[J]. PloS one, 2009, 4(3): e4730.

[21]Horowitz MA, Zunszain PA, Anacker C,etal. Glucocorticoids and inflammation: a double-headed sword in depression? How do neuroendocrine and inflammatory pathways interact during stress to contribute to the pathogenesis of depression?[J]. Mod Trends Pharmacopsychiatry, 2013, 28(28): 127-143.

[22]Tang MM, Lin WJ, Zhang JT,etal. Exogenous FGF2 reverses depressive-like behaviors and restores the suppressed FGF2-ERK1/2 signaling and the impaired hippocampal neurogenesis induced by neuroinflammation[J]. Brain Behav Immun, 2017, 66:322-331.

[23]Marin IA, Goertz JE, Ren T,etal. Microbiota alteration is associated with the development of stress-induced despair behavior[J]. Sci Rep, 2017, 7: 43859.

[24]Yip LY, Aw CC, Lee SH,etal. The Liver-Gut Microbiota Axis Modulates Hepatotoxicity of Tacrine in the Rat[J]. Hepatology, 2018,67(1):282-295.

[25]Fung TC, Olson CA, Hsiao EY. Interactions between the microbiota, immune and nervous systems in health and disease[J]. Nat Neurosci, 2017, 20(2): 145-155.