聚己内酯/聚三亚甲基碳酸酯静电纺丝支架材料的制备与组织相容性研究

张国权,王　宇,周　栋,郑　俊,金　迅,江　涛*

(1中国人民武装警察部队后勤学院临床医学系,天津　300309;2兰州大学第二附属医院血管外科;*通讯作者,E-mail:jiangtao-wjhq@sina.com)

利用机体作为生物反应器,将生物可降解材料制成的血管假体植入体内,经过材料降解和宿主细胞的组织重塑,获得新生血管的策略是解决临床小口径动脉血管严重不足的有效途径[1,2]。聚己内酯(polycaprolactone,PCL)具有良好的力学性能,易于组织工程支架的加工制作;具有良好的生物相容性,支持多种细胞的黏附生长并可在体内缓慢降解[3]。采用静电纺丝技术制备的PCL人工血管已经得到广泛研究,但由于其在体内降解缓慢,往往因为自体细胞及毛细血管难以长入支架或严重钙化而不能最终形成不含支架材料的自体血管[4]。聚三亚甲基碳酸酯[poly(1,3-trimethylene carbonate),PTMC]与PCL相似,同属线性脂肪族聚酯,但PTMC比PCL具有更好的弹性,而且在体内能够较快降解[5]。因此,本研究采用静电纺丝技术,将PTMC与PCL相结合制备PCL/PTMC静电纺丝纤维支架材料;采用扫描电镜、傅里叶红外光谱、热分析仪、单轴拉伸试验等检测方法膜状支架材料的形态特征、化学组成、热稳定性及力学性能;采用小鼠皮下组织埋置实验观察异物反应、材料降解及细胞长入情况,为获得理想的血管移植物材料提供实验基础和理论依据。

1　材料与方法

1.1　主要试剂与仪器

PCL、PTMC购于山东岱罡生物材料有限公司;二氯甲烷(dichloromethane,DCM)、N-二甲基甲酚胺(N,N-dimethylformamide,DMF)购于天津科瑞思化学试剂有限公司。

主要仪器包括:扫描电镜(VegaII-LMH,Tescan,Cz)、红外光谱仪(5DXC,Thermo Nicolet,USA)、热分析仪(EXTAR6000 TG/DTA630,SEIKO,Japan)及万能材料试验机(Instron,Burlington,Ontario Canada)。

1.2　实验动物

7-8周龄健康雄性BALB/c小鼠36只,体质量22-26 g,购于北京军事医学科学院实验动物中心,SPF级。经普通饲料1周适应性喂养后,用于皮下组织材料埋置实验。

1.3　PCL/PTMC静电纺丝支架材料的制备

以DCM、DMF(3 ∶1,v/v)的混合液为溶剂,以PCL(Mn=80 000)、PTMC(Mn=100 000)为溶质,按以下比例配置浓度为15%的聚合物溶液:PCL(对照);PCL ∶PTMC=3 ∶1;PCL ∶PTMC=3 ∶2;PCL ∶PTMC=1 ∶1。以上聚合物溶液经充分搅拌,分别装入带有18G点胶针头的20 ml注射器中,将带有2 mm外径的不锈钢管安装至旋转接收装置上,调节聚合物溶液浓度、针头-接收装置距离、流量、电压等静电纺丝条件,制备静电纺丝管型支架材料,从不锈钢管上小心取下管型材料,真空干燥24 h,去除残留的有机溶剂和水分,密封包装,-20 ℃保存待用[6]。按上述同样条件,用平板接收装置制备膜状支架材料。

1.4　PCL/PTMC静电纺丝支架材料的表征

将各组膜状PCL/PTMC静电纺丝支架材料真空干燥、喷金后,采用扫描电镜观察材料表面形态特征;采用红外光谱仪测量材料傅里叶红外光谱(Fourier transform infrared(FTIR)spectra),测量范围400-4 000 cm-1;采用热分析仪对材料进行热重分析(thermal gravimetric analysis,TGA)和差热分析(differential scanning calorimetry,DSC),样品量为5 mg左右,升温速10 ℃/min，氮气气氛,流量100 ml/min,测试范围25-500 ℃。

1.5　PCL/PTMC静电纺丝支架材料力学性能检测

采用万能材料试验机,对管型PCL/PTMC及PCL静电纺丝支架材料行单轴拉伸试验,将试样固定于标准压片钳上,设定拉伸初始长度为20 mm,拉伸速度为10 mm/min,绘制材料应力-应变曲线(stress-strain curves),记录并计算断裂应变(strain at rupture),拉伸应力(maximum stress)及弹性模量(elastic modulus)等参数。

1.6　PCL/PTMC静电纺丝支架材料小鼠皮下组织植入实验

BALB/c小鼠36只,随机分为PCL组、PCL/PTMC(3 ∶1)组、PCL/PTMC(1 ∶1)组和PCL/PTMC(1 ∶3)组,每组9只。0.4%戊巴比妥麻醉(4 mg/100 g)动物;切开小鼠背部皮肤,钝性分离皮下组织,制备皮下组织囊;分别植入长1.5 cm,内径2 mm的PCL、PCL/PTMC(3 ∶1)、PCL/PTMC(1 ∶1)和PCL/PTMC(1 ∶3)管型支架;缝合皮下组织及皮肤;手术后动物于清洁级动物室常规饲养。每组动物于材料埋置1周、1月、2月,分别处死3只;取出材料及周围皮下组织,OCT包埋,冰冻切片5-7 μm,HE染色观察异物反应、材料降解及细胞生长情况。

1.7　统计学分析

2　结果

2.1　PCL/PTMC静电纺丝支架材料的形态特征

表面形态是静电纺丝材料的重要特征之一。扫描电镜观察结果显示,PCL静电纺丝支架材料具有纤维多孔性结构,纤维直径粗细不等,直径均值为(352±127)nm(见图1A)。PCL/PTMC(3 ∶1)、PCL/PTMC(1 ∶1)组与PCL组材料表面形态相似,同样具有纤维多孔性结构,但随着材料中PTMC含量的增加,纤维直径及纤维间孔隙逐渐变小,且直径分布较为均匀,其直径均值分别为(323±109)nm、(307±78)nm(见图1B、C)。PCL/PTMC(1 ∶3)组与其他三组材料相比,静电纺丝纤维出现融合,失去纤维多孔性结构,材料表面可见分布不均,大小不一的圆形窗孔,结构较为致密(见图1D)。

A. PCL　 　 　　B. PCL/PTMC 3 ∶1　　　　 　C. PCL/PTMC 1 ∶1　　　　　D. PCL/PTMC 1 ∶3图1　PCL-PTMC静电纺丝支架材料的形态特征Figure 1　The morphological characters of electrospun PCL/PTMC scaffold materials

2.2　PCL/PTMC静电纺丝支架材料FTIR分析结果

红外谱图分析显示,PCL和PTMC的红外谱图相似,说明PCL与PTMC化学结构类似。在高波段均可观测到亚甲基-CH2的C-H伸缩振动峰(PCL:2 945,2 865 cm-1,PTMC:2 971,2 909 cm-1),在PCL/PTMC复合材料中该振动峰发生重叠;PCL和PTMC的羰基-CO峰分别在1 725 cm-1和1 744 cm-1,而复合纤维中碳基位置介于二者之间;此外,PCL的1 295,1 244和1 191 cm-1吸收峰在复合纤维图谱中可见,并随着PCL含量减少,其峰强变弱(见图2)。

2.3　PCL/PTMC静电纺丝支架材料TGA与DSC分析结果

热重分析(TGA)实验结果显示,PCL失重区主要位于325-475 ℃,失重50%温度(Td50%)为409.7;PTMC失重区主要位于300-330 ℃,Td50%为313.9;PCL/PTMC复合支架材料失重区位于PCL、PTMC之间,PCL/PTMC(3 ∶1)Td50%为355.9 ℃,PCL/PTMC(1 ∶1)Td50%为327.0 ℃,PCL/PTMC(1 ∶3)Td50%为319.0 ℃(见图3)。差示扫描量热分析(DSC)实验结果显示,PCL熔点(Tm)为66.8 ℃,PTMC熔点温度未测出;PCL/PTMC静电纺丝支架材料中,随着PTMC含量的增加,PCL熔点降低,PCL/PTMC(3 ∶1)中Tm为63.6 ℃,PCL/PTMC(1 ∶1)中Tm为64.0 ℃,PCL/PTMC(1 ∶3)中Tm为62.1 ℃。PCL热分解温度(Td)为417.1 ℃,PTMC为319.3 ℃,PCL/PTMC静电纺丝支架材料中,PCL、PTMC的热分解温度轻微降低(见图4)。

图2　PCL-PTMC静电纺丝支架材料傅里叶红外光谱分析Figure 2　The FTIR spectra of electrospun PCL/PTMC scaffold materials

图3　PCL/PTMC静电纺丝支架材料热重分析Figure 3　The TGA thermograms of electrospun PCL/PTMC scaffold materials

2.4　PCL/PTMC静电纺丝支架材料力学单轴拉伸实验结果

PCL与不同配比PCL/PTMC管型支架材料典型的应力-应变曲线(stress-strain curves)见图5。PCL管型支架材料断裂应变(strain at rupture)为(112.19±23.04)%,拉伸应力(maximum stress)为(1.75±0.09)MPa,弹性模量(Young’s modulus)为(4.72±0.72)MPa。PCL/PTMC管型支架材料与PCL管型支架材料相比,弹性模量有所增加。其中PCL/PTMC(3 ∶1)断裂应变为(131.72±25.00)%,拉伸应力为(2.62±0.24)MPa,弹性模量为(9.34±0.76)MPa,不但具有与PCL管型支架材料相似的纤维性多孔结构,而且具有较好的力学性能。各组材料详细数据见表1。

图4　PCL/PTMC静电纺丝支架材料DSC分析Figure 4　The DSC thermograms of electrospun PCL/PTMC scaffold materials

图5　PCL/PTMC静电纺丝支架材料应力-应变曲线Figure 5　The stress-strain curves of electrospun PCL/PTMC scaffold materials

2.5　PCL/PTMC静电纺丝支架材料小鼠皮下组织植入实验结果

HE染色显示,各组支架材料植入1周,在管型材料外周、内腔及管壁材料内部可见较多炎性细胞(粒细胞、单核/巨噬细胞、淋巴细胞等)聚集,细胞外基质逐渐沉积,形成不明显的纤维包膜。由于PCL、PCL/PTMC(3 ∶1)、PCL/PTMC(1 ∶1)材料具有纤维性多孔结构,结构较疏松,进入管壁外层的细胞数明显多于PCL/PTMC(1 ∶3)组(见图6A1-D1)。植入1月,各组管型材料外周、内腔及材料内部和炎性细胞明显减少,在PCL、PCL/PTMC(3 ∶1)、PCL/PTMC(1 ∶1)组材料中,可见宿主细胞长入管壁外层,侵蚀厚度分别为(23.94±2.76)%,(23.06±2.62)%和(22.29±2.80)%,无统计学差异(P>0.05)。PCL/PTMC(1 ∶3)组由于材料结构较为致密,自体细胞难以长入,材料表面可见侵蚀性降解,降解后的管壁材料由新生自体组织代替。PCL/PTMC(1 ∶1)、PCL/PTMC(1 ∶3)组材料周围细胞外基质沉积较PCL、PCL/PTMC(3 ∶1)明显增多,形成较为完整的纤维包膜(见图6A2-D2)。植入2月,PCL组材料宿主细胞侵蚀度为(23.85±3.71)%,较之植入1月无明显变化,而PCL/PTMC(3 ∶1)、PCL/PTMC(1 ∶1)组宿主细胞侵蚀厚度明显增加,分别为(26.83±3.71)%,(29.15±2.33)%,与PCL组相比,具有统计学差异(P<0.05)。PCL/PTMC(1 ∶3)较之植入1月,管壁厚度未发生明显变化,而管壁周围纤维结缔组织包膜厚度明显增加(图6A3-D3)。

表1PCL/PTMC静电纺丝支架材料的力学特征

Table1ThemechanicalpropertiesofelectrospunPCL/PTMCscaffoldmaterials

支架材料拉伸应力(MPa)断裂应变(%)弹性模量(MPa)PCL1.75±0.09112.19±23.044.72±0.72PCL/PTMC(3∶1)2.62±0.24131.72±25.009.34±0.76PCL/PTMC(1∶1)1.74±0.24 78.36±10.716.52±0.54PCL/PTMC(1∶3)1.04±0.2437.83±9.446.72±0.85

图6　小鼠皮下组织植入各组支架材料HE染色结果Figure 6　The results of electrospun PCL/PTMC scaffold materials implanted in subcutaneous space of mice by HE staining

3　讨论

随着生物可降解材料和组织工程支架制备工艺的不断发展,提出了原位组织工程血管的概念。原位组织工程血管,也可称为生物可吸收性人工血管,是将患者的机体作为生物反应器,采用生物可降解材料构建管型支架,当支架植入机体后,宿主细胞持续渗入基质,产生胶原蛋白、弹性蛋白及蛋白多糖等ECM成分,逐渐替代可降解的支架材料,最终形成一个包含自体细胞的功能化新血管[1,2]。这种方法可减少宿主对移植物的反应,增加血管假体的开放率,具有简便易行、成品易于保存的特点,适合工业化生产,因此具有良好研发前景。实际上,原位组织工程血管的概念并不新颖,早在20世纪60年代,Wesolowski等[7]就首先提出生物可吸收血管假体的概念。半个世纪以来,已有很多不同的方法和材料用于该领域的研究,但一直未能成功得到商业性的血管移植物产品。究其原因,主要是目前还未能很好解决“支架降解”和“组织再生”之间的平衡问题。降解速率快的生物材料,往往因为血管支架已经降解,但新生组织并未长入而造成动脉瘤破裂[4]。反之,降解速率慢的生物材料,又往往因为自体细胞及毛细血管难以长入支架,或严重的钙化而不能最终形成不含支架材料的自体血管[8]。

PCL是由ε-己内酯开环聚合所得的线性脂肪族聚酯,是20世纪30年代由Carothers Group合成的最早的聚合物之一[3]。20世纪90年代后,组织工程研究的发展促使PCL得到极大的关注。这主要是因为PCL具有以下特点:具有出众的力学性能,易于组织工程支架的加工制作;具有良好的生物相容性,支持多种细胞的黏附生长;可以在体内缓慢降解,且降解产物能够被组织很快吸收。采用静电纺丝技术制备的PCL人工血管已经得到了广泛研究。de Valence等[4]将小口径的PCL静电纺丝人工血管植入大鼠腹主动脉,并进行了18个月的长期实验观察。研究结果表明,PCL血管假体能在研究期内保持开放和结构的完整,在实验的前6个月,自体细胞和新生毛细血管在管壁持续增加,但6-12月中,长入的自体细胞逐渐退化,毛细血管密度降低,并出现严重的钙化现象。

南开大学Wang等[9]认为,上述结果可能与PCL人工血管较为稠密的静电纺丝纤维有关,稠密的纤维造成较小的支架孔隙,限制了宿主细胞的渗入和管壁的再生重塑,因此该研究组通过调整聚合物溶液浓度,喷头与接收装置距离,静电发生器电压等电喷条件,构建出粗纤维、大孔隙的PCL静电纺丝人工血管。大鼠血管移植实验表明,粗纤维、大孔隙的支架材料明显增加细胞渗入和细胞外基质分泌,植入3个月,管壁内腔内皮覆盖完全,管壁有丰富的平滑肌细胞和细胞外基质再生,结构与天然血管相似,且具有收缩和舒张功能。美国匹兹堡大学Wu等[10]则提出,相比于孔隙大小,支架材料的降解速度可能更为重要,因为支架材料的快速降解能为细胞渗入、增殖、细胞外基质分泌提供更大的空间,而且减少生物材料的宿主应答时间,长期持续的宿主应答可能是造成人工血管纤维化、钙化及内膜增生的原因。因此该研究组采用能够快速降解的聚癸二酸丙三醇酯[poly(glycerol sebacate),PGS]弹性材料构建人工血管假体,植入大鼠腹主动脉3个月后,支架材料几乎完全降解,完全由宿主细胞组织构成的新生血管随之产生。尽管,Wu等[10]的研究结果令人振奋,但考虑到人类的组织再生能力远远弱于啮齿类动物,快速降解的血管假体很容易造成动脉瘤,甚至血管破裂。因此,如何得到一种更为理想的可降解支架材料显得尤为重要。

PTMC与PCL相似,同属线性脂肪族聚酯。体内的生物相容性和毒性分析显示,PTMC对心、肝、肾等重要器官无影响,采用PTMC制备的多孔支架支持人脐静脉内皮细胞、平滑肌细胞和间充质干细胞等多种细胞的黏附与生长[5]。与PCL的主要区别在于,PTMC具有更好的弹性,而且能在体内能够较快降解[11]。本研究组的前期实验及相关文献表明[6,12],采用8%-16%的PCL/PTMC混合溶液能够得到稳定的静电纺丝纤维,且随着PTMC含量的增加,纤维直径增粗。当PCL与PTMC质量比大于1时,PCL/PTMC静电纺丝支架材料呈纤维性多孔结构,当质量比小于1时,静电纺丝纤维发生融合,逐渐失去纤维性多孔结构。为了得到粗纤维大孔隙的PCL/PTMC支架材料,本文采用15%的PCL/PTMC混合溶液进行电喷,通过扫描电镜、傅里叶红外光谱、热分析仪及单轴拉伸试验等检测方法对各组支架材料的形态特征、化学组成、热稳定性及力学性能进行表征研究,结果显示,随着PTMC含量的增加,支架材料的物理、化学特征发生相应变化。扫描电镜观察显示PCL/PTMC(3 ∶1)、PCL/PTMC(1 ∶1)与PCL支架材料具有相似的纤维多孔性结构,但纤维直径与孔隙减小;PCL/PTMC(1 ∶3)支架材料发生纤维融合,失去纤维性多孔结构,这些变化可能主要由于随着PTMC含量的增加,聚合物溶液的黏度、表面张力及电导率发生相应变化。傅里叶红外光谱显示PCL/PTMC支架材料中PCL与PTMC分子间作用较弱,特征峰无明显改变,这可能主要由于PCL与PTMC长链分子中缺乏-OH、-NH2等活性基团而引起。TGA和DSC分析显示PCL/PTMC支架材料热稳定性介于PCL和PTMC之间,随着PTMC含量的增加而降低,PTMC可能通过影响静电纺丝中PCL长链分子的排列方向而影响PCL的热稳定性。单轴拉伸试验显示PCL/PTMC(3 ∶1)支架材料具有较大的断裂应变,而PCL/PTMC(1 ∶3)组材料断裂应变明显减小,说明PTMC含量与材料的形态特征是影响PCL/PTMC支架材料力学性能的主要因素。

为了解PCL-PTMC的组织相容性,本研究采用小鼠皮下组织植入实验观察异物反应、材料降解及细胞长入情况,结果显示,PCL、PCL/PTMC(3 ∶1)、PCL/PTMC(1 ∶1)材料植入1周、1月,宿主对所植入的三组材料反应基本相似,植入1周主要表现为炎症细胞浸润,植入1月急性炎症反应消退,宿主细胞长入材料管壁外层,且细胞侵蚀度相似。但植入2月,PCL/PTMC(3 ∶1)、PCL/PTMC(1 ∶1)组宿主细胞侵蚀厚度明显增加,分别为(26.83±3.71)%、(29.15±2.33)%,与PCL组相比,具有统计学差异(P<0.05),提示支架材料中PTMC含量的增加可能有助于宿主细胞对支架材料重塑与改建。PCL/PTMC(1 ∶3)材料虽然含有较多PTMC,但由于材料致密,缺乏孔隙,宿主细胞难以长入材料内部,只在材料表面出现较为明显的侵蚀性降解。纤维多孔性的PCL/PTMC静电纺丝支架材料可能是一种较为理想的原位组织工程血管支架材料。由于PTMC的降解主要涉及由M1型巨噬细胞/FBGCs介导的侵蚀降解过程[13],因此我们将在今后实验中进一步研究PCL/PTMC静电纺丝支架材料对巨噬细胞表型及功能的影响。

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