长链非编码RNA LINC01128对肾癌细胞增殖和侵袭的影响及其机制

龚　化,周治军,卢　童,徐　康,鲁　文

(1天门市第一人民医院泌尿外科,天门　431700;2天门市第一人民医院神经内科;*通讯作者,E-mail:luwenwh2005@163.com)

肾癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一,其发病率呈逐年上升趋势。肾癌对放化疗均不敏感,早期肾癌主要采取手术治疗,但手术方式的进步并未明显改善肾癌患者的预后[1,2]。肾癌发生发展的具体机制至今仍不明确,寻找调控肾癌增殖、侵袭等生物学行为的基因已成为肾癌防治研究领域的重要方向[3]。长链非编码RNA(lncRNA)是近年来肿瘤研究的热点,在多种肿瘤中表达异常,在肿瘤中的调控作用逐渐引起人们的关注[4,5]。LINC01128是一种新发现的lncRNA,其在肿瘤特别是肾癌中的具体作用及机制尚不清楚。本研究通过qPCR检测发现LINC01128在肾癌细胞株中表达降低,从而进一步探索了LINC01128对肾癌细胞A498的增殖和侵袭的影响,并在基因及蛋白水平对其作用机制进行了研究,为寻找肾癌的新治疗靶点方面提供了实验基础。

1　材料与方法

1.1　细胞株和主要试剂

肾癌细胞株A498、ACHN、786-O、OS-RC-2和人近端肾小管上皮细胞HK-2购自上海拜力生物科技有限公司;RPMI-1640培养液和胎牛血清购自美国HyClone公司;阴性对照质粒、LINC01128高表达质粒及PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司构建;Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司;荧光实时定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司;一抗PTEN、CDK4、Cyclin D1、E-cadherin、N-cadherin和GAPDH均购于美国CST公司;细胞周期检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;CCK-8试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司;Transwell小室购自美国Corning公司。

1.2　细胞培养和转染

在37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱内,采用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养液培养肾癌细胞A498、ACHN、786-O和OS-RC-2,采用含10% FBS的DMEM/F12培养基培养人近端肾小管上皮细胞HK-2。选取对数生长期的A498细胞进行转染操作,根据Lipofectamine 2000说明书进行转染操作,分别瞬时转染实验分为对照组(转染阴性对照质粒)和实验组(转染LINC01128高表达质粒)。

1.3　qPCR检测LINC01128和PTEN mRNA表达

消化收集细胞,用TRIzol法提取细胞总RNA,逆转录为cDNA,采用荧光实时定量PCR试剂盒进行qPCR检测,以GAPDH为内参。LINC01128引物上游5′-GTCGGGTTCTGTTGGAGTG-3′,下游5′-CGAGATCATGCCATTGTGAC-3′。PTEN引物上游5′-TGGATTCGACTTAGACTTGACCT-3′,下游5′-GGTGGGTTATGGTCTTCAAAAGG-3′。GAPDH引物上游5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′,下游5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。qPCR扩增条件为:95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s、58.8 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,35个循环。qPCR阈值Ct值以2-ΔΔCt分析处理。

1.4　Western blot检测PTEN蛋白及相关蛋白表达

选取对数期各组细胞,消化收集A498细胞,加入RIPA裂解液提取细胞总蛋白,测定蛋白浓度,取40 μg蛋白经聚丙烯酰氨凝胶电泳后,转移至PVDF膜,5%脱脂牛奶封闭2 h,4 ℃下与一抗孵育过夜,室温下与二抗孵育2 h,滴加ECL显影液曝光显影。

1.5　流式细胞术检测细胞周期分布

选取对数期各组细胞,消化收集A498细胞,预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次,预冷的70%乙醇溶液重悬细胞,4 ℃固定过夜。离心后用PBS溶液洗涤2次,100 μl PBS溶液重悬细胞,加入5 μl RNase A溶液,37 ℃水浴15 min,加入5 μl碘化丙啶溶液后在4 ℃避光孵育15 min,加入PBS溶液400 μl,充分混匀后,应用流式细胞仪检测两组A498细胞周期。

1.6　克隆形成实验检测细胞增殖能力

选取对数期各组细胞,消化收集A498细胞,以1×103个/孔接种于6孔板,连续培养直到肉眼可见清晰的细胞克隆。弃上清,1 ml甲醇固定10 min,1 ml 0.1%的结晶紫溶液染色10 min,流水洗去多余染液,室温下晾干,每孔取4个视野计数细胞克隆数,取平均值。

1.7　CCK-8法检测细胞增殖活性

选取对数期各组细胞,消化收集A498细胞,以5×103个/孔接种于96孔板,每组设4个复孔。分别在培养的第1,2,3,4,5天加入10 μl CCK-8溶液,培养箱中培养5 h,终止培养,吸去培养液,每孔加入150 μl二甲基亚砜,振荡10 min,酶标仪测定490 nm波长各孔的吸光度(OD值)。

1.8　Transwell实验检测细胞侵袭能力

在Transwell上室内每孔加入40 μg基质胶进行包被,培养箱内放置4 h,待基质胶充分凝固。选取对数期各组细胞,消化收集A498细胞,用无血清培养液制成单细胞悬液,上室中接种细胞3×104个/孔。下室加入含10% FBS的培养液,继续培养24 h。取出上室,用棉签拭去上室内未穿过膜的细胞,0.1%的结晶紫染液将小室多孔膜下表面的细胞染色,显微镜下观察,每孔取4个视野计数细胞数,取平均值。

1.9　统计学分析

2　结果

2.1　肾癌细胞株中LINC01128的表达

qPCR结果显示，肾癌细胞株A498、ACHN、786-O、OS-RC-2和人近端肾小管上皮细胞HK-2中LINC01128的表达分别为0.18±0.08，0.60±0.10，0.44±0.07，0.55±0.13和1.02±0.24(P<0.05，见图1)，A498细胞中LINC01128的表达最低，表明LINC01128可能参与肾癌的发生发展。

与对照组(HK-2)比较,*P<0.05,**P<0.01图1　qPCR检测肾癌细胞株中LINC01128表达情况Figure 1　Expression of LINC01128 in renal cancer cell lines by qPCR

2.2　A498细胞中LINC01128和PTEN mRNA的表达

qPCR结果显示，对照组和实验组A498细胞中LINC01128相对表达量分别为1.09±0.57和72.27±13.78(t=10.320,P<0.001)，A498细胞中PTEN mRNA相对表达量分别为1.03±0.29和4.10±1.15(t=5.179,P=0.002)。实验组中LINC01128和PTEN mRNA的相对表达量显著高于对照。

2.3　高表达LINC01128对肾癌细胞PTEN蛋白及相关蛋白表达的影响

Western blot结果显示,与对照组相比,实验组中PTEN和E-cadherin蛋白表达升高,CDK4、Cyclin D1和N-cadherin蛋白表达降低(见图2),表明LINC01128具有促进PTEN蛋白表达的作用。

图2　Western blot检测PTEN及相关蛋白的表达Figure 2　Expression of PTEN and related proteins by Western blot

2.4　高表达LINC01128对肾癌细胞周期分布的影响

流式细胞术显示,实验组中G0/G1期细胞比例显著高于对照组(P<0.01),S期和G2/M期细胞比例显著低于对照组(P<0.05,见表1),表明LINC01128可抑制A498细胞周期的进展。

分组G0/G1期S期G2/M期对照组41.84±3.8229.97±3.5528.19±4.88实验组61.06±5.96**18.33±4.03**20.61±2.58*

与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01

2.5　高表达LINC01128对肾癌细胞增殖活性的影响

CCK-8法结果显示，在第4天，对照组和实验组A498细胞的吸光度OD值分别为1.88±0.19和1.18±0.12(t=6.261，P<0.001)。在第5天，对照组和实验组细胞的吸光度OD值分别为2.67±0.47和1.51±0.24(t=4.385，P=0.005)，实验组的肾癌A498细胞吸光度明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05，见图3)。表明高表达LINC01128的A498细胞的增殖活性受到抑制。

2.6　高表达LINC01128对肾癌细胞克隆形成能力的影响

克隆形成实验显示，对照组和实验组A498细胞形成的克隆数分别为191.68±35.69和71.23±29.05(t=5.234，P=0.002，见图4)。与对照组相比，实验组肾癌细胞形成的克隆数显著减少(P<0.05)，表明高表达LINC01128后肾癌细胞的克隆形成能力被抑制。

与对照组比较,*P<0.05,**P<0.01图3　CCK-8法检测LINC01128对肾癌细胞增殖活性的影响Figure 3　Effect of LINC01128 on the proliferation of renal cell carcinoma cells detected by CCK-8 assay

图4　LINC01128对肾癌细胞克隆形成能力的影响Figure 4　Effect of LINC01128 on colony forming ability of renal cell carcinoma cells

2.7　高表达LINC01128对肾癌细胞侵袭能力的影响

Transwell实验结果显示,对照组和实验组A498细胞穿过多孔膜的细胞数分别为122.55±33.40和32.62±11.82(t=5.076,P=0.002,见图5),实验组肾癌细胞穿膜能力明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。提示高表达LINC01128的A498细胞的侵袭能力受到抑制。

图5　LINC01128对肾癌细胞侵袭能力的影响Figure 5　Effect of LINC01128 on invasive ability of renal cell carcinoma cells

3　讨论

肾癌的发病是一个综合病因导致的复杂过程,目前尚未研究透彻[6]。由于肾癌对放、化疗均不敏感,研究调控肾癌细胞增殖、侵袭等的相关基因一直是研究热点[7,8]。长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸的不编码蛋白的内源性RNA分子,在肿瘤的发生发展中发挥重要的调节作用[9]。已有研究发现,lncRNA的表达异常与肾癌的发生发展密切相关。lncRNA如PVT1、ROR、Z38等具有促进肾癌细胞增殖或转移的作用,表现为癌基因的作用[10-12]。另一些lncRNA如EGOT、SDPR-AS、CASC2等在肾癌细胞中发挥抑癌作用[13-15]。LINC01128是一种新发现的lncRNA,其调控肿瘤如肾癌的具体机制尚处于研究阶段。

本研究通过qPCR检测,LINC01128在肾癌细胞株中的表达量低于人近端肾小管上皮细胞,尤其在A498细胞中LINC01128表达量降低的更为显著。PTEN被普遍认为是一种抑癌基因,具有磷酸酶活性[16]。PTEN在肾癌组织和细胞中表达降低,与肾癌的增殖和转移等生物学行为密切相关,通过促进PTEN基因的表达,可能会抑制肾癌细胞的增殖和转移[17,18]。本研究证实,高表达LINC01128可明显促进PTEN基因的表达。本实验结果表明,高表达LINC01128后的肾癌细胞周期进展被抑制,细胞的增殖活性和增殖能力降低,细胞的侵袭能力下降,表明高表达LINC01128具有抑制肾癌细胞增殖和侵袭的作用。Western blot实验显示,高表达LINC01128促进PTEN基因的表达后,CDK4、Cyclin D1和N-cadherin蛋白的表达水平降低,E-cadherin蛋白的表达水平增加。Cyclin D1和CDK4可形成复合物,调控细胞周期G-S进度。G1期阻滞导致A498细胞不能进入S期合成DNA,从而抑制了细胞增殖[19]。LINC01128可能通过抑制CyclinD1-CDK4复合物的形成,阻滞细胞周期,进而抑制A498细胞增殖。上皮间质转化(EMT)是指上皮细胞失去极性,上皮细胞表型如E-cadherin蛋白表达降低,减值表型N-cadherin蛋白表达升高,细胞黏附力下降,细胞迁移和侵袭能力增强[20]。LINC01128可能通过抑制N-cadherin蛋白的表达、促进E-cadherin蛋白的表达,从而间接抑制A498细胞的迁移和侵袭能力。

综上所述,本研究表明LINC01128在肾癌细胞株中呈低表达,高表达LINC01128可能阻滞A498细胞于G0/G1期,抑制肾癌肾胞的增殖和侵袭能力,作用机制可能为LINC01128促进细胞中PTEN基因的表达,从而抑制肿瘤细胞的生长。为LINC01128作为肾癌的诊断指标,以及预防和治疗肾癌提供实验依据。

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