沙格雷酯下调肺动脉高压大鼠右室TRPC1、TRPC6通道及calcineurin A/NFATc3表达

韩俊丽,田红燕,刘　亚,范粉灵

(1西安交通大学第二附属医院重症医学科,西安　710004;2西安交通大学第一附属医院周围血管科;3西安交通大学第一附属医院呼吸科;*通讯作者,E-mail:tianhhyy@mail.xjtu.edu.cn)

肺动脉高压发展过程中,肺血管阻力增高,右室后负荷增高,发生右室肥厚,继而发生右心衰竭[1]。右室功能是影响肺动脉高压病人预后的重要的决定因素[2-4]。右心和左心的胚胎发育、结构和功能不同,目前对右心系统的研究不够透彻。5-HT是一种血管活性物质,肺动脉高压时血清中的5-HT升高,与肺动脉高压的发生关系密切[5]。5-HT对肺动脉高压时右心系统影响的分子机制尚不明确。以往研究表明TRPC通道和calcineurin/NFAT信号通路与细胞增殖、心肌肥厚的发生关系密切[6-10]。本研究观察了肺动脉高压大鼠右室的TRPC通道和calcineurin/NFAT信号通路表达改变,并观察了5-HT2A受体拮抗剂沙格雷酯对右室TRPC通道和calcineurin/NFAT信号通路表达的影响,初步探索了肺动脉高压时右心的分子和信号通路改变。

1　材料和方法

1.1　主要试剂与仪器

野百合碱(美国Sigma公司),沙格雷酯(日本三菱株式会社),TRPC1抗体(以色列Alomone公司),TRPC6抗体(以色列Alomone公司),Calcineurin A抗体(美国Santa Cruz公司),NFATc3抗体(美国Santa Cruz公司),GAPDH单克隆抗体(美国Epitomics公司),HRP标记的多克隆抗体(英国Abcam公司)。荧光定量PCR检测系统(美国Bio Rad公司,Bio-Rad iQ5),凝胶成像分析系统(美国Bio Rad公司,ChemiDocTM)。

1.2　实验动物及分组

雄性4周龄SD大鼠18只,体质量150-200 g(清洁级,购自西安交通大学医学院实验动物中心)。采用随机数字法随机分为对照组、肺动脉高压组和沙格雷酯组,每组6只。干预方法如下:①对照组：每日腹腔注射生理盐水1 ml，每日给予生理盐水1 ml灌胃；②肺动脉高压组：每日腹腔注射野百合碱(50 mg/kg)，每日给予生理盐水1 ml灌胃；③沙格雷酯组：每日腹腔注射野百合碱(50 mg/kg)，每日给予沙格雷酯灌胃(100 mg/kg)。干预4周时取右室组织。

1.3　RT-PCR检测大鼠右室TRPC1、TRPC6、calcinneurin A/NFATc3的mRNA表达

取右室组织约50 mg,Trizol提取组织总RNA,反转录为cDNA,逆转录多聚酶链反应检测右室中TRPC1、TRPC6、calcinneurin A、NFATc3的表达。反应条件:预变性95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40个循环。计算ΔΔCt=(Ct实验组-Ct实验组内参)-(Ct对照组-Ct对照组内参)。再计算2-ΔΔCt分析mRNA相对表达量。

1.4　Western blot检测大鼠右室TRPC1、TRPC6、calcinneurin A/NFATc3的蛋白表达

取右室组织约50 mg,提取蛋白,-80 ℃保存。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,将蛋白转印至硝酸纤维素膜。将硝酸纤维素膜以5%脱脂奶粉室温慢摇封闭1 h。加一抗(稀释比:TRPC1 1 ∶200,TRPC6 1 ∶200,calcineurin A 1 ∶500,NFATc3 1 ∶100,GAPDH 1 ∶1 000)孵育过夜。TBST洗后加二抗(稀释比:HRP标记的多克隆抗体1 ∶5 000),室温慢摇孵育1 h。TBST洗3次,TBS洗1次。用化学发光法放入凝胶成像系统成像。Quantity One软件进行图像分析。

1.5　统计学分析

结果以均数±标准差表示。SPSS 13.0软件进行统计。采用方差分析进行组间相互比较。P<0.05认为差异有统计学意义。统计图表采用GraphPad Prism 5制作。

2　结果

2.1　沙格雷酯对肺动脉高压大鼠右室TRPC通道和calcineurin A/NAFTc3 mRNA表达的影响

大鼠腹腔注射野百合碱,建立肺动脉高压模型[11]。对大鼠右室心肌组织的TRPC通道和calcineurin A/NAFTc3mRNA表达进行分析,肺动脉高压组的TRPC1、TRPC6、calcineurin A和NFATc3的mRNA表达较对照组增高(P<0.05,见图1)。5-HT2A受体拮抗剂沙格雷酯干预4周,沙格雷酯组的TRPC6、calcineurin A、NFATc3 mRNA表达较肺动脉高压组降低(P<0.05，见图1);沙格雷酯组的TRPC1 mRNA表达较肺动脉高压组降低,但差异无统计学意义。以上结果说明沙格雷酯可减弱肺动脉高压大鼠右室的TRPC6、calcineurin A、NFATc3的mRNA表达。

2.2　沙格雷酯对肺动脉高压大鼠右室TRPC通道和calcineurin A/NAFTc3蛋白表达的影响

对肺动脉高压大鼠右室心肌组织的TRPC通道和calcineurin A/NAFTc3蛋白表达进行分析。肺动脉高压组的右室TRPC1、TRPC6、calcineurin A、NFATc3蛋白表达较对照组增高(P<0.05,见图2);沙格雷酯组的右室TRPC1、TRPC6、calcineurin A、NFATc3蛋白表达较肺动脉高压组降低(P<0.05,见图2)。以上结果说明沙格雷酯可减弱肺动脉高压大鼠右室的TRPC1、TRPC6、calcineurin A、NFATc3蛋白表达。

3　讨论

肺动脉高压可导致右室肥厚,最终导致右心衰竭。右心衰竭是肺动脉高压病人预后的重要决定因素[3,4]。接受治疗后病情稳定或病情改善的肺动脉高压病人,其心输出量更好,右室重构更轻,右室功能更好[12]。右室的后负荷过重可导致右室肥厚,但有研究表明仅后负荷过重还不足以导致右心衰竭,可能因为血管重构释放的介质进一步影响右室肥厚,导致右心衰竭[13-15]。因此,对肺动脉高压时右心衰竭的分子机制研究十分必要。5-HT是一种血管活性物质,肺动脉高压时血清中的5-HT升高,与肺动脉高压的发生关系密切[5]。以往对右心衰竭机制的研究多是以左心衰竭为模型,而左心和右心在结构和功能上有较大区别[16,17]。本研究对动脉高压大鼠的右室组织进行检测,结果表明右室心肌中TRPC1、TRPC6通道表达和calcineurin A/NFATc3表达上调,5-HT2A受体拮抗剂沙格雷酯可降低肺动脉高压大鼠右室心肌中的TRPC1、TRPC6通道表达和calcineurin A/NFATc3表达。沙格雷酯干预后,TRPC1的mRNA表达下降但差异无统计学意义,可能与样本量小有关。既往研究表明TRPC通道和calcineurin/NFAT通路与心肌肥厚、心肌重构、肺动脉高压关系密切,但对右心的相关研究较少。TRPC通道活化导致钙离子相关的信号通路活化,引起心肌肥厚和重构[18]。过表达TRPC6的转基因小鼠对压力负荷更敏感,表现为心脏肥厚和心肌收缩功能降低[19]。过表达TRPC3的转基因小鼠的钙库操纵的钙离子内流(SOCE)增加,NFAT活性增加,并发展为心肌肥厚、心脏功能受损,calcineurin Aβ基因缺失可减弱TRPC3转基因小鼠的心肌肥厚[20]。TRPC1基因缺失小鼠在压力负荷或神经体液应激条件下不表现心脏肥厚和心力衰竭[21]。主动脉缩窄致左室肥厚的大鼠模型中,左室心肌TR-PC1表达增高[22]。钙调神经磷酸酶(calcineurin,CaN)是异源二聚体的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶,参与多种细胞反应。钙调神经磷酸酶包括催化亚单位(calcineurin A)和调节亚单位(calcineurin B)。活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T-cells,NFAT)通路控制心血管系统发生过程中的许多步骤,有5个类型,NFATc1-c5[9,10,23]。TRPC通道开放和细胞内钙离子增高可进一步促进calcineurin/NFAT信号通路活化,促进细胞增殖、心肌肥厚[10,19,20,24]。

与对照组比较,*P<0.05;与肺动脉高压组比较,#P<0.05图1　沙格雷酯对肺动脉高压大鼠右室TRPC1、TRPC6、calcineurin A和NFATc3 mRNA表达的影响(n=6)Figure 1　The effect of sarpogrelate on the mRNA expression of TRPC1, TRPC6, calcineurin A and NFATc3 in the right ventricle of rats with pulmonary hypertension(n=6)

1.对照组；2.肺动脉高压组；3.沙格雷酯组；与对照组比较,*P<0.05;与肺动脉高压组比较,#P<0.05图2　沙格雷酯对肺动脉高压大鼠右室TRPC1、TRPC6、calcineurin A和NFATc3蛋白表达的影响(n=6)Figure 2　The effect of sarpogrelate on the protein expression of TRPC1, TRPC6, calcineurin A and NFATc3 in the right ventricle of rats with pulmonary hypertension(n=6)

综上所述,TRPC通道和calcineurin/NFAT信号通路是心肌肥厚、心脏衰竭中重要的分子和信号,本研究观察到肺动脉高压大鼠的右室TRPC1、TRPC6、calcineurin A/NFATc3表达上调,5-HT2A受体拮抗剂沙格雷酯可以抑制肺动脉高压大鼠右室的TRPC1、TRPC6、calcineurin A/NFATc3过表达。对于肺动脉高压时右心功能机制的深入研究有助于更深入理解肺动脉高压的发病机制,寻找更好的治疗靶点。

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