池蝶蚌STAT基因的克隆及功能分析

舒福兴　周　伟　盛军庆　王军花　王小敏　高　沁　洪一江

(1. 南昌大学生命科学学院，江西省水产动物资源与利用重点实验室，南昌 330031; 2. 南昌大学医学院，南昌 330031)

信号转导及转录激活因子(Signal transducer and activator of transcription, STAT)是一种胞浆蛋白, 控制很多重要的生物应答, 进化上功能保守[1],广泛参与细胞分化、凋亡、免疫调节等众多细胞因子信号转导的重要途径[2]。Awersik等[3]对果蝇的性腺研究发现JAK激酶激活的STAT通路与性别有关; 在哺乳动物中鉴定出来有7个750—850个氨基酸STAT蛋白[4]。STAT含有4个功能保守结构域：STAT蛋白互作结构域(STAT protein, protein interaction domain, STAT_int)、α-螺旋卷曲结构域(STAT protein, all-alpha domain, STAT_alpha)、DNA结合结构域(STAT protein, DNA binding domain, STAT_bind)、SH2结构域(Src homology 2),同时还具有高度分化及主要差异部位的羧基末端转录激活区(Carboxy-terminal transcriptional activation domain, TAD)。

付友等[5]在鲤鱼的组织差异性表达分析中发现STAT 1/2/4在头肾和脾脏中表达最高; Ray等[6]的研究发现斑马鱼暴露于砷刺激下TLR/Socs等基因都涉及JAK/STAT招募; Hanson等[7]研究发现雌激素刺激虹鳟10—30min后, JAK/STAT信号通路快速被抑制; Wu等[8]研究发现黄颡鱼JAK/STAT信号通路在转录水平调节瘦素; 兰江风等[9]研究发现在甲壳类动物中弧菌刺激能够引起STAT的磷酸化, 进一步研究发现弧菌表面分子脂多糖(LPS)可以诱发STAT的磷酸化过程; Bathige等[10]研究发现盘鲍Ab-STAT5基因应答革兰氏阴性菌、病毒、脂多糖的刺激, 并推断Ab-STAT5参与了盘鲍先天性免疫;Huang等[11]研究发现插核受伤的合浦珠母贝中Pf-STAT参与了病毒的免疫应答; Zhang等[12]等研究光滑双脐螺的STAT1和STAT2发现这些转录因子参与了其对吸虫的响应, 为动物免疫系统的进化提供了新的视角; Canesi等[13]研究发现： 在异源细胞因子和细菌的刺激下, 紫怡扇贝血细胞通过酪氨酸激酶介导STAT-like家族成员开启免疫应答; 大量的研究表明STAT家族承担着多种重要的功能, 然而在淡水育珠贝中鲜有报道。池蝶蚌是优质的淡水育珠蚌, 鉴于STAT基因在免疫及性别调控中的重要作用, 本文克隆了池蝶蚌STAT基因(HsSTAT)并对该基因进行生物信息学分析, 为选育抗病、优产珠的池蝶蚌做前期工作。

1　材料与方法

1.1　实验材料

池蝶蚌取自江西省洪门水库国家级池蝶蚌良种场。9只3龄健康蚌, 体型正常, 张闭有力, 体长(137.62±9.41) mm, 体重(260±10) g。实验室水族箱暂养1周, 水温18—25℃, 每天换提前曝气的自来水1次。

1.2　实验方法

RACE-PCR引物的设计根据本实验室高通量测序获得的转录组数据中筛选出HsSTAT的部分片段设计引物如表1, 由上海生物工程技术服务公司合成。

总RNA的提取与cDNA的合成从池蝶蚌血细胞中以Trizol法提取总RNA, 用于qPCR的RNA从10个组织中提取; 根据Clontech公司的SMART RACE cDNA Amplification Kit试剂盒的要求合成5′RACE-Ready cDNA和3′RACE-Ready cDNA。

HsSTAT序列的克隆和测序鉴定以UPM通用引物分别和5′、3′端的GSP引物, 分别用5′RACE-Ready cDNA和3′RACE-Ready cDNA为模板进行RACE-PCR。反应体系为： PrimeSTAR HS(Premix)12.5 μL, GSP引物 1 μL, UPM引物 1 μL, 模板 1 μL, ddH2O 9.5 μL, 共25 μL; 反应程序为： 95℃预变性3min; 95℃变性10s, 55℃ 退火5s, 72℃延伸30s, 35个循环。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收, 切胶回收步骤按照OMEGA公司的DNA回收试剂盒说明进行操作。由于PrimeSTAR酶的高保真性, 回收产物进行加“A”反应。反应体系为： Taq 酶1 μL, 10×buffer 2 μL, dNTP 1 μL, 回收产物16 μL, 共20 μL;反应条件为72℃孵育1h。将加“A”后的产物按照OMEGA产物纯化试剂盒纯化之后与pMD19-T载体连接, 转入大肠杆菌DH5α感受态菌中; 培养12 h后挑取单克隆到1 mL AMP+终浓度为100 μg/mL的LB液体培养基中, 37℃ 250 r/min培养9h; 菌液PCR验证后送上海生物工程技术有限公司测序。

生物信息学分析将测序后的序列片段经过MEGA4软件拼接之后在NCBI (https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)中进行全序列比对,ORF框的寻找, 氨基酸的序列推导, 相应蛋白结构的分析, 氨基酸的同源比对, 用MEGA软件构建NJ系统进化树, Bootstrap重复1000次。用在线软件Prabi (https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)对蛋白的二级结构进行预测; 用SWISS MODEL(https：//swissmodel.expasy.org/interactive/qVzz5X/models/)对蛋白序列进行三级结构预测; 用GPSSUMO软件对序列进行小泛素相关修饰物(small ubiquitin-related modifier, SUMO)预测; 用GSP-Lipid 1.0对序列进行蛋白棕榈酰化、法尼基化、N-端豆蔻酰化、香叶酰香叶酰化位点的预测; 用NetPhos 3.1(http：//www.cbs.dtu.dk/cgi-bin/webface2.fcgi?jobid=57FA778700004B57B570D3E5&wait=20)在线软件对序列的磷酸化位点进行预测。

表1　用于实验的引物信息Tab. 1　The primer information for experiments

亚细胞定位按照Barcia[14]的血细胞取样方法抽取池蝶蚌血细胞用于培养, 培养方法如下： 用注射器从池蝶蚌的闭壳肌抽取1 mL血液, 向血液中加入1%肝素钠, 混匀, 放于100 μL ALS缓冲液中(葡糖糖20.8 g/L, 柠檬酸钠 8 g/L, EDTA 3.36 g/L)轻轻混合均匀, 200 g/min离心5min收集细胞, 血球计数板计数到105个/mL, 以混有10%小牛血清的RPMI 1640培养基及100ul双抗溶液重悬血细胞迅速转移到6孔细胞培养板中, 置于25℃, 5% CO2的培养箱中进行培养; 以上述cDNA为模板, DW-F为上游引物, DW-R为下游引物, 反应体系为： PrimeSTAR HS(Premix)12.5 μL, 引物各 1 μL, 模板 1 μL, ddH2O 9.5 μL, 共25 μL; 反应程序为： 95℃预变性3min;95℃变性10s, 55℃ 退火5s, 72℃延伸30s, 35个循环,获得带酶切位点的PCR HsSTAT-ORF产物。以限制性内切酶XhoL I和 BamH I对带酶切位点的产物和pEGFP-c1载体进行双酶切, 切割之后用Omega PCR产物纯化试剂盒进行纯化, 最后用T4 DNA连接酶将切开的质粒和HsSTAT-ORF产物连接过夜,测序鉴定正确后大量提取重组质粒, 以没有加入质粒的池蝶蚌血细胞为空白对照, 以DNA∶转染试剂体积=3 μg∶6 μL的比例转染入准备好的池蝶蚌血细胞中, 培养24h后在波长488 nm下利用倒置荧光显微镜观察亚细胞定位结果, 转染效率=图中发出荧光的细胞数量/图中细胞的总数。

分子原位杂交(Fluorescence in situ hybridization, FISH)用10 mL注射针抽取池蝶蚌血于1.5 mL离心管中, 取 10 μL适当稀释血液均匀涂抹于干净的多聚赖氨酸处理过的载玻片上晾干, 3%H2O2室温10min, 蒸馏水洗3次，每次5min; 暴露mRNA核酸片段： 切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶, 37℃消化10min, 原位杂交用PBS洗3次，每次5min, 蒸馏水洗1次，每次5min; 1%多聚甲醛室温固定10min, 蒸馏水洗3次，每次5min; 用DEPC水按1∶200的比例稀释杂交液, 每张切片滴加20 μL杂交液, 用盖玻片盖在切片上, 阴性对照以PBS代替杂交液, 恒温箱41℃杂交过夜, 探针序列为TZ (上海生工合成); 37℃左右的2×SSC洗涤2次，每次5min,37℃左右的0.5×SSC洗涤15min, 37℃左右的0.2×SSC洗涤2次，每次15min; 原位杂交用PBS洗3次，每次5min, 甘油封片, 荧光显微镜下观察。

池蝶蚌各组织中HsSTAT的表达分析混合提取3只池蝶蚌性腺、鳃、心脏、外套膜、肠、肾、肝胰腺、闭壳肌、血和斧足共10种组织的总RNA, 通过1%琼脂糖凝胶电泳检验RNA完整性。将RNA反转为cDNA模板; 以β-actin为内参基因。根据荧光定量试剂盒(TaKaRa)进行qRT-PCR检测。20 μL PCR反应体系为： SYBR 10 μL, 上、下游引物各0.4 μL, H2O 8.2 μL, 模板1 μL。每个样品设置3个平行。反应条件为： 95℃预变性5min; 94℃变性30s, 58℃退火30s, 72℃延伸30s, 40个循环;72℃延伸10min。采用伯乐qPCR仪自带的分析软件以 2-ΔΔCt法进行表达分析。

HsSTAT对SMCC-7721的增殖影响将SMCC-7721细胞密度达到80%—90%时, 用0.05%胰蛋白酶分别消化单层细胞, 消化离心收集后, 将上清去掉, 加入2 mL完全培养基使其混匀, 计数细胞浓度, 终浓度为2×104个/mL; 用枪分别将细胞接种到3个96孔板中, 每孔加100 μL细胞悬液, 待细胞贴壁之后以转染试剂∶质粒=1 μL∶3 μg的比例转染以VC-F和VC-R为引物构成的重组质粒pBIFCVC155-HsSTAT至细胞中, 同时设置空白对照组, 阴性对照组, 24h后向孔中加入10 μL的CCK8试剂(注意不要在孔中生成气泡, 气泡会影响OD值得读数),迅速放回细胞培养箱中孵育1h, 之后用酶标仪测试吸光度, 波长=450 nm, 最后按照如下公式进行计算：

增殖率=实验组OD值/空白组OD值×100%

实验组： 具有转染重组质粒的细胞、CCK8和培养基。

阴性对照组： 具有培养基和CCK8溶液和pBIFC-VC155空载体。

空白组： 具有没有转染的细胞、CCK8溶液和培养基。

数据统计荧光定量实验进行3次重复数据通过伯乐荧光定量PCR仪自带软件用2-ΔΔCt进行处理分析; 细胞增殖实验每组设置3个复孔, 重复3次,以SPSS 20统计软件, 配对T检验进行数据统计, 显著性设置为P＜0.05, 以EXCEL作图。

2　结果

2.1　HsSTAT基因的全长序列分析

根据设计的引物获得的5′-RACE PCR和3′-RACE PCR产物大小分别为261和448 bp。拼接的HsSTAT (GenBank ID：KY123702)全长为2752 bp,5′端121 bp, 3′端264 bp, ORF框2367 bp, 共编码789个氨基酸。包含了4个经典的结构域, 在125—367 bp含有81个氨基酸的STAT_int, 542—1099 bp处, 含有186个氨基酸STAT_alpha, 1118—1849 bp之间, 含有244个氨基酸STAT_bind, 1820—2227 bp处含有136个氨基酸的SH2结构域。BLAST分析显示,所扩增的序列为池蝶蚌的STAT基因的全长cDNA。

2.2　HsSTAT 基因序列的生物信息学分析

HsSTAT 蛋白氨基酸组成分析经在线软件ExPASy (http：//web.expasy.org/cgi-bin/compute_pi/pi_tool)推导出HsSTAT基因编码788个氨基酸, 预测分子量为90.024 kD, 理论等电点为5.75, 该蛋白显弱酸性。该序列中氨基酸的占有比例Var最高为12.9%, Lys最低为0.5%。

HsSTAT蛋白亲水性与疏水性分析将Hs-STAT的蛋白序列在ExPASy (http：//web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl?1)分析, 参数采用Hphob/Kyte＆Doolitle标度。进行亲疏水分析发现疏水性氨基酸(Ala、Cys、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Val、Pro)占39.8%, 亲水性蛋白(Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、Gly、His、Lys、Ser、Thr、Tyr)占60.2%, 平均疏水性指数为-0.531, HsSTAT为亲水性氨基酸。

HsSTAT蛋白结构预测分析将HsSTAT蛋白序列导入NCBI Protein BLAST, 网址为： https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome,比对之后发现其具有4个STAT经典的结构域。

HsSTAT蛋白的二级结构预测及分析将HsSTAT蛋白序列在Prabi (https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)分析发现α螺旋含46.83%、β折叠含8.5%、延伸链占15.36%、无规则卷曲占29.31%; α螺旋在整个序列都有分布, 但是主要集中在这个序列的前段及中部, 无规则卷曲、延伸链和β折叠分布在全序列中, 但主要集中在中后区。

HsSTAT蛋白的三级结构预测通过SWISS MODEL对HsSTAT氨基酸的三级结构的预测显示在相应的氨基酸位置上的确出现了用Prabi在线软件预测的二级结构, 而且在NCBI中比对的HsSTAT_int、HsSTAT_alpha、HsSTAT_bind、SH2四个结构域在预测的三级结构域中也存在; 这说明预测的HsSTAT蛋白的三级结构具有一定的可信度。

HsSTAT蛋白的棕榈酰化、法尼基化、N端豆蔻酰化、香叶酰香叶酰化位点、磷酸化位点的预测通过GPS-lipid 1.0 对HsSTAT蛋白的棕榈酰化、法尼基化、N端豆蔻酰华、香叶酰香叶酰化位点进行预测, 在274—288 bp处存在1个棕榈酰化位点, 位点信息为： LETIQSWCESLAEII。通过GPSSUMO软件对HsSTATA氨基酸序列的小泛素化修饰进行预测发现2个小泛素化位点和1个小泛素修饰作用位点(表2)。

2.3　HsSTAT基因的系统进化分析

对各个物种HsSTAT保守位点氨基酸使用频率分析发现色氨酸(W)在保守位点上的使用频率最高, 多个保守位点的使用频率达到100%, 其次是苯丙氨酸(F), 这说明STAT基因在进化的过程中依然保留着最原始的一些特征, 并且随着物种的进化选用了适合自身的氨基酸。通过构建系统进化树发现各种类型的STAT比较保守, HsSTAT与光滑双脐螺STAT5B和盘鲍的STAT5聚为一支, 和鱼类、鸟类、灵长类不在一支, 这说明HsSTAT在进化的过程中趋向保守(图2)。

2.4　亚细胞定位分析

图1　HsSTAT的三级结构示意图Fig. 1　Schematic diagram of the tertiary structure of HsSTAT

表2　GSP-SUMO软件预测的HsSTAT蛋白序列的小泛素化修饰位点Tab. 2　Prediction of small ubiquitination modification sites in HsSTAT protein sequence from GSP-SUMO software

HsSTAT的亚细胞定位显示, 在空白对照组中没有出现荧光, HsSTAT在血细胞中的定位在细胞质中(图3), 荧光原位杂交FISH实验显示, 在正常的池蝶蚌血细胞中HsSTAT-RNA主要存在于细胞核中, 在细胞质中没有发现杂交信号(图4)。

图2　HsSTAT系统进化树(三角形指示HsSTAT所在进化位置)Fig. 2　Phylogenetic tree of HsSTAT system (triangle represents the position of HsSTAT)

2.5　池蝶蚌各组织中HsSTAT的表达分析

对池蝶蚌血细胞、鳃、肝胰腺、外套膜、肾、斧足、闭壳肌、性腺、肠、心脏十个组织中HsSTAT的表达进行qPCR研究发现HsSTAT在所有的组织中均有表达, 表达量从高到低的顺序依次为肝胰腺＞肠＞鳃＞肾＞心脏＞性腺＞闭壳肌＞斧足＞外套膜＞血细胞(图5)。

2.6　HsSTAT对SMCC-7721的增殖影响

细胞增殖实验表明(图6), 设置空白对照增殖为100%, 与空白对照相比阴性对照组的增殖率为101%, 实验组增殖率为119%, 可见HsSTAT可以促进SMCC-7721细胞系的增殖。

3　讨论

3.1　生物信息学分析

HsSTAT首次在优质淡水育珠贝池蝶蚌中报道。通过对HsSTAT结构域的预测以及与其他物种的氨基酸比对发现其含有STAT_int、STAT_alpha、STAT_bind、SH2四个保守的结构域。STAT_int是参与蛋白互作的结构域, 当细胞因子或生长因子与之结合时, STAT特异的激活靶基因的转录调控, 而STAT_alpha和STAT_bind结构域负责蛋白与DNA的相互作用[15], 这暗示着HsSTAT具有典型的STAT的功能; 由于JAK和STAT家族成员较多, 承接信号来源广泛, 因此JAK/STAT信号通路的研究成为最近几年的研究热点[16—19], HsSTAT是否涉及JAK/HsSTAT通路有待研究, 李菲菲等[20]报道STAT会被胞浆内酪氨酸蛋白激酶分子Tec家族(非受体性酪氨酸激酶家族)调控。随后有研究指出LITAF与胞浆中活化的STAT形成复合体在进入细胞核启动TNF-a、IL-2/6等细胞因子的表达[21]。这说明STAT家族基本上是在胞浆和细胞核中传送生物信号, 这为研究HsSTAT的功能提供亚细胞水平上的启示。

图3　HsSTAT在血细胞中的亚细胞定位(绿色荧光代表重组蛋白pEGFP-c1-HsSTAT的位置)Fig. 3　Subcellular localization of HsSTAT in hemocyte (green fluorescence represents the location of the recombinant protein pEGFP-c1-HsSTAT)

图4　HsSTAT-RNA在正常血细胞中的定位Fig. 4　The localization of HsSTAT-RNA in normal hemocyte

图5　HsSTAT在各个组织中的表达情况Fig. 5　The expression of HsSTAT in different tissues

图6　HsSTAT对SMCC-7721细胞的增殖影响(“*”代表P＜0.05)Fig. 6　The effects of HsSTAT on proliferation of SMCC-7721 cells (“*”represent P＜0.05)

在对HsSTAT保守结构域上氨基酸的使用频率进行对比发现, 色氨酸(W)在保守结构位点上被非常高频率的使用, 亲疏水分析显示蛋白是亲水性蛋白, 磷酸化位点分析找出3个以酪氨酸(Y)为中心的催化位点, 然而酪氨酸在HsSTAT整条序列的占有比例仅有2.6%, 与其他物种相同保守位点氨基酸的使用频率相比较未见100%使用酪氨酸, 这似乎暗示着各物种的STAT基因进化的过程中在保守位点上对酪氨酸的选择具有差异性。虽然HsSTAT在进化的过程中对酪氨酸的选择频率不高, 而且这些少数酪氨酸并不是都能和附近的氨基酸一起形成磷酸化位点, 这暗示HsSTAT在进化的过程中对酪氨酸激酶修饰的磷酸化位点有比较严格的要求。

蛋白的棕榈酰化修饰可以调节蛋白的活性、稳定性、膜融合及胞内转运, 介导蛋白定位于亚细胞器参与调节多种细胞信号通路, 介导蛋白与蛋白、蛋白与脂质的相互作用[22], 对HsSTAT进行预测发现其存在棕榈酰化修饰位点, 这暗示着HsSTAT具有从蛋白质、磷脂基团获取信号的能力, 这个位点正好落在NCBI数据库预测到的STAT_alpha结构域中它们具有相似的作用, 不同的软件对这段结构域预测出相同的功能, 加大了可信度。

法尼基化使蛋白质更容易结合细胞膜。在HsSTAT的氨基酸序列中未预测到N端豆蔻酰位点, 因此预测HsSTAT可能不会存在于细胞膜上。亚细胞定位发现pEGFP-c1-HsSTAT重组蛋白定位在细胞核或者细胞质中与生物信息学的预测吻合, HsSTAT并不存在于细胞膜上[23]。

被香叶酰香叶酰化修饰的蛋白质可以结合到细胞膜上, 一方面参与肿瘤的生长与增殖, 另一方面参与血管的形成, 肿瘤的侵袭与转移[24]。HsSTAT氨基酸序列中没有发现能被香叶酰香叶酰化修饰的序列, Xiaoren Tang[21]的研究表明LITAF与STAT6进入细胞核中诱导TNF-α表达让肿瘤细胞步入凋亡阶段, 这与蛋白香叶酰香叶酰化的功能截然不同。

小泛素相关修饰物(Small ubiquitin-ralated modifier, SUMO)是一种泛素样分子。SUMO化修饰的蛋白质很稳定, 可以调节蛋白质之间的相互作用、在核浆间的转运、定位和转录活性等[25—29]。通过GPS-SUMO软件中预测到HsSTAT中有2个SUMO化位点和1个SUMO作用位点, 这暗示着HsSTAT可以携带某些蛋白进入细胞核或者进入细胞质中, 而它自身并不会参与携带蛋白的降解。

对HsSTAT的系统进化分析发现, HsSTAT与光滑双脐螺和盘鲍的STAT5/STAT5B聚为一支, 从进化地位上符合池蝶蚌的进化地位, 且HsSTAT可能为是HsSTAT5亚型。

3.2　HsSTAT各组织中的表达结果及其亚细胞定位

肝胰腺作为贝类重要的免疫器官, 其具有合成免疫相关蛋白的功能, 血细胞同样是重要的免疫系统组成部分, 在正常的情况下, 血细胞中免疫有关的蛋白维持在较低水平有利于免疫系统的稳定,HsSTAT在肝胰腺中的高表达以及在血细胞中的低表达水平暗示HsSTAT或许在贝类的免疫防御中起着重要的作用。在HsSTAT的亚细胞定位中发现HsSTAT在细胞质中表达, 这与生物信息学的预测基本吻合, 虽然在激光共聚焦下观察到了细胞核,但是由于本实验中没有使用DAPI进行核染色加上转染效率偏低, 因此还需要后续实验验证HsSTAT是否在细胞核中表达。HsSTAT-RNA的杂交信号仅出现在血细胞核中, 我们结合HsSTAT在血细胞中表达量最低, 推测在正常血细胞中HsSTAT-mRNA很少进行转录, 当收到相关分子信号后, HsSTAT在细胞质中进行翻译, 携带JAK的细胞信号进入细胞核中启动相关细胞因子表达[30]。

3.3　HsSTAT促进SMCC-7721增殖

本研究发现相对于空白对照组和阴性对照组,实验组显著提高了SMMCC-7721的增值率。有研究证明下调STAT5可以抑制SMCC-7721增殖[31]和白血病恶性肿瘤的增殖[32], 结合上述生物信息学的结果HsSTAT可能为STAT5亚型, 行使着促进癌细胞增殖的作用。生物信息学中没有预测到香叶酰香叶酰化修饰, 这似乎暗示HsSTAT不通过香叶酰香叶酰化修饰途径促进SMCC-7721的增殖。因此,HsSTAT作为外源物种的基因是由何种机制引发肿瘤细胞的增殖还有待挖掘。

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