睡美人转座子在草鱼CIK细胞中介导的高效基因整合

陈　凯　薛　亭　王艺舟　潘启华　于　淼,　陈天圣

(1. 华中农业大学水产学院, 农业部淡水生物繁育重点实验室, 武汉 430070; 2. 河南师范大学水产学院, 河南省水产动物养殖工程技术研究中心, 新乡 453007)

转基因技术是生物学研究中的一个热点, 构建稳定的转基因鱼类细胞系对研究鱼类基因功能和转基因鱼具有重要价值。在鱼类细胞中, 外源基因整合效率偏低, 稳定的转基因细胞系难以获得, 因此寻找一种稳定高效的转基因方法在鱼类转基因研究中尤为重要。

睡美人(Sleeping Beauty, SB)转座子属于Tc1/mariner转座子家族, 普遍存在于脊椎动物基因组中。但在生物体漫长进化过程中由于突变累积失去了活性。1997年Ivics等[1]在鲑科鱼类基因组中运用生物信息学方法恢复了转座子的活性。SB转座子能携带外源DNA在转座酶的催化作用下, 以“剪切和粘贴”的方式发生转座, 偏向于随机插入基因组中TA序列处[2]。2009年Mates等[3]通过高通量定点突变得到目前转座活性最高的转座酶SB100X,它能显著提高SB转座子转座效率。SB转座子系统是一种很好的基因转移载体, 具有整合效率高、外源基因能长期稳定表达、低拷贝整合、插入位点随机分布等特点, 因此它被广泛运用于转基因、插入诱变、基因治疗等研究中[4]。其他转座子如piggyBac[5]、Tol2[6]、Tgf2[7]等也常被作为基因转移载体, 但有研究表明SB转座子比piggyBac和Tol2转座子具有更高的转座活性[8,9]。SB转座子系统能在体细胞[10]、T细胞[11]、干细胞[12]等多种细胞中介导外源基因高效整合。Gallardo-Galvez等[13]发现了SB转座子系统在多种鱼类细胞中具有转座活性。SB转座子也运用于获得转基因鱼, He等[14]将携带外源基因的SB转座子载体和SB11转座酶mRNA共同显微注射至罗非鱼受精卵中, 待转基因罗非鱼发育成熟后与野生型成鱼杂交, 在F1和F2代罗非鱼基因组中均能检测到外源基因的存在。此外运用SB转座子系统已经成功获得了多种转基因动物, 如小鼠[15]、猪[16]、牛[17]、斑马鱼[18]等。因此SB转座子系统能在转基因研究中发挥重要作用。

目前有关SB转座子和具有高效活性的SB100X转座酶系统在鱼类细胞中转座效率和整合位点的研究鲜有报道, 草鱼(Ctenopharyngodon idellus)全基因序列图谱的完成也为鉴定转座子插入位点提供了重要基础[19]。因此本实验以草鱼CIK细胞为实验材料, 构建了以DsRed为外源报告基因的SB一元和二元转座子系统, 以不同比例的转座子与转座酶共转染CIK细胞, 用荧光显微镜、流式细胞仪和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测了外源基因DsRed的转染和整合效率, 通过高效热不对称交互式PCR(hiTAIL-PCR)扩增出转座子在基因组中插入位点的DNA序列并对整合位点进行初步分析, 为利用SB转座子在鱼类细胞中实现高效基因整合和构建大规模的突变库奠定基础。

1　材料与方法

1.1　菌种、质粒和细胞

感受态大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α购自北京全式金生物技术有限公司, 载体pT2/BH由Perry Hackett馈赠(Addgene plasmid #26556),SB100X转座酶载体pCMV (CAT) T7-SB100(pSB)由Zsuzsanna Izsvak馈赠(Addgene plasmid#34879), 载体pCV-pr由新加坡国立大学洪云汉教授馈赠, pIRES-DsRed质粒和草鱼CIK细胞由本实验室保存。

1.2　睡美人转座子载体构建

在pCV-pr质粒上设计引物Pr-F和Pr-R (表1),以pCV-pr质粒为模板通过PCR扩增得到2.4 kb报告元件CMV-Pac-DsRed, 用ClonExpress II试剂盒(Vazyme, 南京)将其连接至用BglⅡ和EcoRⅤ酶切的pT2/BH线性化质粒上, 构建成SB转座子表达载体pT2, 它与转座酶表达载体pSB共同组成SB二元反式(trans)转座系统。在pSB质粒上设计引物SBF和SB-R(表1), 以pSB为模板通过PCR扩增得到1.3 kb的SB转座酶片段; 在SB转座子pT2上设计引物T2Pr-F和T2Pr-R(表1), 以pT2为模板PCR扩增得到2.9 kb的转座子表达元件T2/CMV-Pac-DsRed, 用ClonExpress II试剂盒(Vazyme, 南京)将SB转座酶片段和T2/CMV-Pac-DsRed片段连接至NotⅠ和NheⅠ酶切的pIRES-DsRed线性化质粒, 构建成SB一元反式(cis)转座子表达载体pT2_SB, 所有酶切正确的质粒送公司测序(武汉擎科生物)。

1.3　不同比例转座子和转座酶共转染细胞

在12孔板中接种密度为1×105个/孔的CIK细胞,当细胞汇合度达到70%时用LipofectamineTM2000(Invitrogen, 美国)转染CIK细胞。实验设置5个实验组, 每组3个重复, 第1组： 转染一元转座子pT2_SB;第2组： 转染转座子pT2; 第3组： 转染pT2∶pSB=10∶1;第4组： 转染pT2∶pSB=2∶1; 第5组： 转染pT2∶pSB=1∶2。转染48h后在荧光显微镜下观察, 统计细胞总数和红色荧光细胞数目, 计算得到各实验组细胞中红色荧光细胞比例。随后对各实验组细胞进行嘌呤霉素筛选, 细胞培养基中添加1 μg/mL嘌呤霉素, 每3d换1次含嘌呤霉素的培养基, 持续4周。

1.4　流式细胞仪分析

嘌呤霉素筛选4周后, 在荧光显微镜下观察细胞。使用BD FACSVerseTM细胞分析仪(BD, 美国)测定各实验组细胞中DsRed阳性细胞比例及相对荧光强度, 每个实验组测定细胞数为1×104个, 对照组为未转染的CIK细胞。

1.5　总RNA提取和半定量PCR

用Trizol裂解法提取嘌呤霉素筛选4周后各实验组细胞RNA, 分别取1 μg RNA用PrimeScript®RT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa, 日本)试剂盒合成第一链cDNA。半定量PCR引物根据外源基因DsRed序列设计, 其序列为DsRed-F和DsRed-R(表1), 目的带为150 bp。草鱼β-actin基因(M25013.1)作为内参, 引物为β-actin-F和β-actin-R(表1), 目的条带为154 bp。20 μL的半定量PCR体系包括2×Taq Master Mix (Takara, 日本) 10 μL、双蒸水8 μL、上下游引物各0.5 μL(10 μmol/L)和cDNA 1 μL。半定量PCR反应条件为： 94℃ 3min; 94℃ 20s, 58℃ 30s,72℃ 15s, 35个循环; 72℃ 10min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

表1　本研究所用的引物序列Tab. 1　Primers used in this study

1.6　荧光定量PCR

以各实验组细胞的cDNA为模板, DsRed-F和DsRed-R为引物(表1), 用Bio-rad CFX Connet实时定量PCR仪(Bio-rad, 美国)进行荧光定量PCR反应,检测DsRed相对表达量, 草鱼β-actin作为内参基因(表1)。20 μL PCR反应体系包括2×SYBR®Premix Ex TaqTM(Takara, 日本)10 μL、RNA-free水6.8 μL、上下游引物各0.6 μL (10 μmol/L)和cDNA 2 μL。PCR反应程序为： 95℃ 2min; 95℃ 5s, 58℃ 20s,39个循环; 65℃缓慢上升至95℃(0.5℃/5 s)。每个样品采用3个平行, DsRed的相对表达量用2-ΔΔCt法进行计算。

1.7　基因组DNA提取和高效热不对称交互式PCR

用蛋白酶K消化法提取稳定表达DsRed的CIK细胞(pT2∶pSB=1∶2组)基因组DNA, 以它为模板进行hiTAIL-PCR反应, 根据转座子载体pT2上的反向重复序列(IR/DR)设计3条特异性引物SP1、SP和SP3(表1), 分别用于第1轮、第2轮和第3轮hi-TAIL-PCR反应。简并引物LAD1、LAD2、LAD3、LAD4和AC1(表1), 各轮PCR反应体系及反应程序均参考Liu等[20]。对第2轮和第3轮PCR产物进行TA克隆并送公司测序, 测序序列与草鱼基因组序列(http：//www.ncgr.ac.cn/grasscarp/)进行比对, 分析SB转座子在草鱼基因组中的插入位点。

2　结果

2.1　转座子pT2和pT2_SB的构建

通过PCR方法构建得到SB转座子载体pT2, 与转座酶载体pSB构成了SB二元反式(trans)转座子系统(图1A)。同时也构建了SB转座子和转座酶表达框在同一个质粒上的一元顺式(cis)转座子载体pT2_SB (图1B)。所构建的SB转座子系统都包含CMV启动子、嘌呤霉素抗性基因和DsRed报告基因。

2.2　不同转座子系统的瞬时转染效率

设置5个实验组, 用不同转座子系统转染CIK细胞, 分别转染一元转座子pT2_SB、转座子pT2(未加转座酶)、pT2∶pSB=10∶1、pT2∶pSB=2∶1和pT2∶pSB=1∶2。48h后, 在荧光显微镜下观察红色荧光,分析得到5组细胞中瞬时转染效率分别为8.3%、10.7%、12.8%、9.1%和6.7%(图2), 表明SB转座子pT2与转座酶pSB比例为10∶1时, DsRed瞬时转染效率最高(12.8%)。

2.3　不同转座子系统的整合效率

嘌呤霉素筛选4周后, 在荧光显微镜下观察红色荧光细胞。发现添加转座酶pSB的实验组(pT2∶pSB=10∶1、2∶1、1∶2)大部分细胞表达出红色荧光蛋白, 并形成密集的细胞群, 而转染一元转座子pT2_SB组和仅转染转座子pT2组红色荧光细胞数量比较少(图3A)。

用流式细胞仪检测细胞中红色荧光细胞比例,发现转染pT2_SB、pT2、pT2∶pSB=10∶1、pT2∶pSB=2∶1和pT2∶pSB=1∶2这5个实验组中, 红色荧光细胞比例分别为58.0%、26.6%、89.9%、87.1%和94.1%(图2)。表明转座子pT2与转座酶pSB比例为1∶2时, 外源基因DsRed整合效率最高, 达到94.1%(图3B)。随后检测DsRed相对荧光强度, 发现转座子pT2与转座酶pSB比例为1∶2时, 细胞相对荧光强度也最大, 是仅转染转座子pT2组荧光强度的21.6倍, 是转染一元转座子pT2_SB组荧光强度的8.7倍(图3C)。

图1　SB转座子系统结构示意图Fig. 1　The structure of SB transposon system

图3　嘌呤霉素筛选后CIK细胞中DsRed的表达检测Fig. 3　The detection of DsRed in CIK cells after puromycin selection

采用半定量PCR验证外源基因DsRed在CIK细胞中的表达情况, 发现在5个实验组细胞中均检测出清晰的目的条带, 对照组没有检测到条带(图3D), 说明外源DsRed片段已经插入基因组中并且能够转录为mRNA。进一步用荧光定量PCR检测各组细胞中DsRed的相对表达量, 结果表明转座子pT2与转座酶pSB比例为1∶2时, DsRed相对表达量最高, 是仅转染转座子pT2组的15.3倍, 是转染一元转座子pT2_SB组的3.3倍(图3E)。

2.4　插入位点的分析

采用hiTAIL-PCR扩增SB转座子插入位点上下游未知的DNA片段, 第2轮和第3轮PCR反应中可以得到出清晰条带(图4), 共获得了大小为49—623 bp的24个片段。与草鱼基因组序列比对后得到了7个不同位点的插入序列, 编号为1—7(表2), 1—6号能准确定位于草鱼基因组中, 其中1、5和6号有多个序列重复, 2、3、4和7号为单一序列, 而且这18个插入序列与转座子末端连接处都为TA二核苷酸,说明了SB转座子偏向于随机整合至草鱼基因组中TA位置, 此外在24个片段中还有6个片段测序确证为转座子pT2自身载体的一部分。

3　讨论

为了研究睡美人转座子系统在鱼类细胞的整合效率以及转座子插入位点的特性, 本实验利用SB转座子在草鱼CIK细胞中进行了测试。结果表明SB二元转座子系统的整合效率远高于一元转座子系统, SB转座子与SB100X转座酶比例为1∶2时外源基因DsRed的整合效率最高, 而且SB转座子在草鱼基因组中偏向于随机整合至TA位置。

图4　插入序列的hiTAIL-PCR产物电泳图Fig. 4　Gel electrophoretogram of hiTAIL-PCR products

表2　SB转座子在草鱼基因组中的插入位置Tab. 2　Inserted sites of SB transposon in grass carp genome

在不同物种或细胞中SB转座子与转座酶的转染比例能影响外源基因整合效率。Kolacsek等[21]发现在人HEK-293细胞中, SB转座子与转座酶比例为1∶2时, 外源基因转染效率最高; Podetz-Pedersen等[22]在小鼠肝脏中发现SB转座子与转座酶比例为50∶1时, 转座效率最高; 周家庆等[23]在猪胎儿成纤维细胞中发现SB转座子与转座酶比例为1∶1时, 外源基因表达量最高。本实验用流式细胞仪和qPCR检测SB一元转座子和不同转座子与转座酶比例的二元转座系统在CIK细胞中的整合效率, 发现SB转座子pT2与转座酶pSB比例为1∶2时, 外源基因DsRed整合效率最高, 这可能是由于适量的转座酶促进更多拷贝插入基因组, 因此优化转座子与转座酶的比例可以提高整合效率。此外SB二元(trans)系统整合效率也高于一元(cis)系统, 这可能是由于在一元系统中, 转座子与转座酶在DNA水平的相对比例为1∶1, 高比例转座酶的持续表达产生了更高的细胞毒性, 使转座活性下降。Huang等[24]报道在T细胞中SB二元转座子系统整合效率至少是一元转座子系统3倍; Podetz-Pedersen等[22]在小鼠肝脏中检测到SB二元转座子系统整合效率大约是一元转座子的5倍, 这些结果都与本实验结果类似。此外有研究报道SB转座酶可通过mRNA或者蛋白质的形式与转座子共同转染细胞[25,26], 可以降低细胞毒性, 提高转座子整合效率。在转染效率较低的CIK细胞中, 经长期的药物筛选后, 加入SB二元转座系统的实验组荧光细胞比例大幅提高, 而没有加入转座酶的细胞荧光比例较低, 表明SB100X转座酶能显著促进外源基因在鱼类细胞中的整合。

有研究对SB转座子插入序列特性进行大量分析, 发现SB转座子倾向于随机整合到基因组TA序列处, 没有明显插入基因内或转录调控区域的倾向[2,27], 而其他转座子如piggyBac和Tol2, 它们偏向于插入基因内或转录起始位点附近[28,29], 可能使细胞产生有害突变, 甚至使细胞死亡。因此SB转座子系统是一种更安全的转基因载体, 在插入诱变和基因治疗等研究中能发挥重要作用。本实验用hi-TAIL-PCR方法在草鱼基因组中快速获得6个不同的转座子插入序列, 它们都定位于基因组TA位置,表明在草鱼基因组中SB转座子也偏好于插入TA的位置, SB转座子在基因组中插入的偏好性对今后开展转座子定向插入的研究具有重要意义。此外有部分扩增序列为转座子质粒pT2本身片段, 表明SB转座子可能发生了自我整合[30], 或者质粒是以其他方式插入到基因组中。

Gallardo-Galvez等[13]用SB11转座子系统转染了5种不同的鱼类细胞, 包括大马哈鱼CHSE-214细胞、虹鳟RTG-2细胞、太阳鱼BF-2细胞、鲤EPC细胞和鲷SAF-1细胞, 只在CHSE-214细胞中SB11转座酶能显著提高转座效率, 未能获得转座子插入位点。本实验采用具有高效活性的转座酶SB100X在草鱼细胞中显著提高了外源基因整合效率, 并快速得到了转座子在草鱼基因组的插入位点。基于SB转座子系统具有整合基因组的高效性、插入位点的随机性、鉴定插入位点的快速性等优点, 我们还在青鱼(Mylopharyngodon piceus)、中华鲟(Acipenser sinensis)、石斑鱼(Epinephelussp)等鱼类细胞进行了测试, 也证实在SB转座子系统能显著提高外源基因整合效率, 快速获得稳定的转基因细胞系(未发表结果)。综上所述, 本实验在草鱼细胞中优化了SB转座子与SB100X转座酶的比例, 研究了SB转座子整合的特性, 提供了一种利用SB转座子系统在鱼类细胞实现高效基因整合的方法, 为构建鱼类细胞突变体库奠定了理论基础。

参考文献：

[1]Ivics Z, Hackett P B, Plasterk R H, et al. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells [J]. Cell,1997, 91(4)： 501—510

[2]Yant S R, Wu X, Huang Y, et al. High-resolution genome-wide mapping of transposon integration in mammals[J]. Molecular and Cellular Biology, 2005, 25(6)：2085—2094

[3]Mates L, Chuah M K, Belay E, et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates [J]. Nature Genetics, 2009, 41(6)： 753—761

[4]Xie F, Gao B, Song C Y, et al. Advances in studies of Sleeping Beauty transposon [J]. Hereditas, 2007, 29(7)：785—792 [谢飞, 高波, 宋成义, 等. “睡美人”转座子的研究进展. 遗传, 2007, 29(7)： 785—792]

[5]Fraser M J, Ciszczon T, Elick T, et al. Precise excision of TTAA-specific lepidopteran transposons piggyBac (IFP2)and tagalong (TFP3) from the baculovirus genome in cell lines from two species of Lepidoptera [J]. Insect Molecular Biology, 1996, 5(2)： 141—151

[6]Koga A, Suzuki M, Inagaki H, et al. Transposable element in fish [J]. Nature, 1996, 383(6595)： 30

[7]Jiang X Y, Du X D, Tian Y M, et al. Goldfish transposase Tgf2 presumably from recent horizontal transfer is active [J]. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology, 2012, 26(7)： 2743—2752

[8]Grabundzija I, Irgang M, Mates L, et al. Comparative analysis of transposable element vector systems in human cells [J]. Molecular Therapy: the Journal of the American Society of Gene Therapy, 2010, 18(6)： 1200—1209

[9]Song C Y. The analysis of transposition activity of different transposons in mammal cell and embryo and the finding of new transposon [D]. Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing. 2014 [宋成义. 不同DNA转座子在哺乳动物细胞和胚胎中转座活性研究及新转座子的挖掘. 博士后研究工作报告, 中国农业科学院, 北京.2014]

[10]Dupuy A J, Akagi K, Largaespada D A, et al. Mammalian mutagenesis using a highly mobile somatic sleeping beauty transposon system [J]. Nature, 2005, 436(7048)：221—226

[11]Jin Z, Maiti S, Huls H, et al. The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor[J]. Gene Therapy, 2011, 18(9)： 849—856

[12]Belay E, Matrai J, Acosta-Sanchez A, et al. Novel hyperactive transposons for genetic modification of induced pluripotent and adult stem cells： a nonviral paradigm for coaxed differentiation [J]. Stem Cells, 2010, 28(10)：1760—1771

[13]Gallardo-Galvez J B, Mendez T, Bejar J, et al. Endogenous transposases affect differently sleeping beauty and frog prince transposons in fish cells [J]. Marine Biotechnology, 2011, 13(4)： 695—705

[14]He X, Li J, Long Y, et al. Gene transfer and mutagenesis mediated by Sleeping Beauty transposon in Nile tilapia(Oreochromis niloticus) [J]. Transgenic Research, 2013,22(5)： 913—924

[15]Horie K, Kuroiwa A, Ikawa M, et al. Efficient chromosomal transposition of a Tc1/mariner- like transposon sleeping beauty in mice [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2001, 98(16)： 9191—9196

[16]Ivics Z, Garrels W, Mates L, et al. Germline transgenesis in pigs by cytoplasmic microinjection of sleeping beauty transposons [J]. Nature Protocols, 2014, 9(4)： 810—827

[17]Garrels W, Talluri T R, Apfelbaum R, et al. One-step multiplex transgenesis via sleeping beauty transposition in cattle [J]. Scientific Reports, 2016, 6： 21953

[18]Davidson A E, Balciunas D, Mohn D, et al. Efficient gene delivery and gene expression in zebrafish using the sleeping beauty transposon [J]. Developmental Biology, 2003,263(2)： 191—202

[19]Wang Y, Lu Y, Zhang Y, et al. The draft genome of the grass carp (Ctenopharyngodon idellus) provides insights into its evolution and vegetarian adaptation [J]. Nature Genetics, 2015, 47(6)： 625—631

[20]Liu Y G, Chen Y. High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences [J]. BioTechniques, 2007, 43(5)： 649—656

[21]Kolacsek O, Erdei Z, Apati A, et al. Excision efficiency is not strongly coupled to transgenic rate： cell type-dependent transposition efficiency of sleeping beauty and piggyBac DNA transposons [J]. Human Gene Therapy Methods, 2014, 25(4)： 241—252

[22]Podetz-Pedersen K M, Olson E R, Somia N V, et al. A broad range of dose optima achieve high-level, long-term gene expression after hydrodynamic delivery of sleeping beauty transposons using hyperactive SB100x transposase [J]. Molecular Therapy Nucleic Acids, 2016, 5(1)：e279

[23]Zhou J Q, Wang S Z, Song C Y, et al. Construction of Sleeping Beauty (SB) transposon vector and its expression in porcine (Sus scrofa) fetal fibroblasts cells [J].Journal of Agricultural Biotechnology, 2013, 21(6)：684—689 [周家庆, 王升智, 宋成义, 等. 睡美人转座子真核表达载体的构建及在猪胎儿成纤维细胞系中的表达验证. 农业生物技术学报, 2013, 21(6)： 684—689]

[24]Huang X, Wilber A C, Bao L, et al. Stable gene transfer and expression in human primary T cells by the sleeping beauty transposon system [J]. Blood, 2006, 107(2)：483—491

[25]Geurts A M, Yang Y, Clark K J, et al. Gene transfer into genomes of human cells by the sleeping beauty transposon system [J]. Molecular Therapy: the Journal of the American Society of Gene Therapy, 2003, 8(1)： 108—117

[26]Wilber A, Frandsen J L, Geurts J L, et al. RNA as a source of transposase for Sleeping Beauty-mediated gene insertion and expression in somatic cells and tissues [J].Molecular Therapy: the Journal of the American Society of Gene Therapy, 2006, 13(3)： 625—630

[27]Luo G, Ivics Z, Izsvak Z, et al. Chromosomal transposition of a Tc1/mariner-like element in mouse embryonic stem cells [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1998, 95(18)：10769—10773

[28]Wilson M H, Coates C J, George A L Jr. PiggyBac transposon-mediated gene transfer in human cells [J]. Molecular therapy: the Journal of the American Society of Gene Therapy, 2007, 15(1)： 139—145

[29]Urasaki A, Morvan G, Kawakami K. Functional dissection of the Tol2 transposable element identified the minimal cis-sequence and a highly repetitive sequence in the subterminal region essential for transposition [J]. Genetics, 2006, 174(2)： 639—649

[30]Wang Y, Wang J, Devaraj A, et al. Suicidal autointegration of sleeping beauty and piggyBac transposons in eukaryotic cells [J]. PLoS Genetics, 2014, 10(3)： e1004103