基于SNP标记的短须裂腹鱼自然群体遗传多样性分析

李光华　金方彭　周　睿　武祥伟　吴俊颉　冷　云　高海涛　张文魁

(1. 云南省渔业科学研究院, 昆明 650111; 2. 云南农业大学, 昆明 650000)

SNP是指在基因组水平上由单个核苷酸碱基的转换或颠换引起的DNA序列多态性, 由于基因组DNA的任何碱基均有可能发生变异, 所以SNP几乎遍布整个基因组, 是动植物中普遍存在的一种分子标记; SNP具有数量多、分布广泛、代表性强、遗传稳定性好、便于高通量、高度自动化检测分析等优点, 通过研究其在生物基因组中的分布即能够全面地反映群体的遗传及变异水平[1]。

短须裂腹鱼[Schizothoraxwangchiachii (Fang)]隶属于鲤形目(Cypriniformes)鲤科(Cyprinidae)裂腹鱼亚科(Schizothoracinae)裂腹鱼属(Schizothorax),分布于金沙江水系, 且其肉质细嫩, 味道鲜美, 是金沙江及其所属支流的主要经济鱼类之一[2]。短须裂腹鱼也是金沙江中游龙开口水电站和阿海水电站进行增殖放流的土著鱼类之一。因此, 短须裂腹鱼具有相对较高的经济价值与生态价值[3]。但近年来, 因其栖息地建设水坝, 栖息环境遭破坏, 加之人类活动影响等原因致使短须裂腹鱼的自然种群资源量急剧下降。目前, 对短须裂腹鱼的研究主要集中在人工驯养、人工繁殖[4]、幼鱼行为学[5]、胚胎发育和仔鱼早期发育特性研究[6]等方面, 还未见短须裂腹鱼的SNP标记开发与遗传多样性水平的研究报道。

本文采用SLAF-seq技术开发了短须裂腹鱼的SNP标记, 并进一步分析了金沙江短须裂腹鱼自然种群的遗传多样性水平。本研究为短须裂腹鱼的种质资源保护与开发利用提供了有效工具及理论依据。

1　材料与方法

1.1　材料

2016年7月于短须裂腹鱼主要分布区域金沙江阿海(N26°50′; E100°42′)和龙开口江段(N27°23′;E100°31′)采集样本20尾, 体长10—15 cm, 体重100—150 g, 取鱼尾鳍固定于液氮中, 并及时保存于-85℃冰箱中备用。

1.2　基因组DNA制备

采用传统的酚-氯仿方法抽提基因组DNA[7], 采用紫外分光光度法与琼脂糖凝胶电泳检测抽提质量并测算基因组DNA的的浓度。抽提的基因组DNA置于-20℃冰箱中备用。

1.3　SLAF-seq文库构建及高通量测序

根据Sun等[15]的方法构建短须裂腹鱼SLAF-seq文库。选择斑马鱼基因组(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=Zebrafish)作为参考基因组进行基因组电子酶切预测, 内切酶的选择原则为： 避免具重复序列的酶切片段, 酶切片段均匀分布于基因组上, 并使酶切片段数符合预期SLAF标签数。操作流程为： 在酶切片段3′端加poly (A)、连接Dualindex专用测序接头、PCR扩增、纯化、混样、切胶回收目的片段, 并将目的片段使用Illumina Hiseq 2500进行双末端测序(PE100)。选用日本晴水稻(Oryza sativa ssp. japonica)基因组(http：//rapdb.dna.affrc.go.jp/)为对照组(Control)(选日本晴水稻(Oryza sativa ssp. japonica)基因组作为对照组是因为它的全基因组序列质量非常好, 比对准确率高), 进行同样流程的测序, 以评估建库方案的准确性。

1.4　SNP标记开发

根据序列相似度, 将聚类于一起的reads定义为一个SLAF标签。根据SLAF标签在不同样品间的等位基因数和基因序列间的差异程度筛选多态性的SLAF标签, 并以每个SLAF标签中测序深度最高的序列类型作为参考序列, 利用bwa[16]将测序reads比对到参考基因组上, 并使用GATK[17]和samtools[18]2种方法开发SNP, 以2种方法得到的SNP标记交集作为最终可靠的SNP标记数据集。

1.5　群体遗传多样性分析

对获取的SNP位点进行筛选, 标准为次要基因型频率(MAF)大于0.05、完整度大于0.8; 使用符合条件的SNP用于短须裂腹鱼群体遗传多样性和遗传结构分析。

使用Power-Marker V3.25软件计算观测等位基因数(Observed allele number, No)、期望等位基因数(Expected allele number, Ne)、观测杂合度(Observed heterozygosity, Ho)、期望杂合度(Expected heterozygosity, He)、多态性信息含量(PIC); 使用Admixture软件[9]分析短须裂腹鱼的群体结构, 使用Cluster软件[10]进行主成分分析, 使用SPAGeDi软件[11]进行个体间的亲缘关系分析, 使用MEGA5软件[8]与Neighbor-Joining算法构建个体间的进化关系分析。

2　结果

2.1　SLAF-seq酶切方案及建库分析

通过对斑马鱼基因组进行酶切预测, 选择RsaⅠ+HaeⅢ内切酶组合酶切短须裂腹鱼基因组,目标酶切片段长度为414—464, 预测可获得144842个SLAF标签(表1)。测序获得日本晴水稻(Control)数据量为0.72 Mreads, 与参考基因组比对,Paired-end mapped reads、single-end mapped reads和unmapped reads占总reads的比例分别为94.73%、1.38%与3.89%(表2); 由此可知, 双端比对效率较高, 比对结果较好。另外, 日本晴水稻测序reads插入片段中残留酶切位点的比列为5.27%, 酶切效率为94.73%, 表明酶切效果较好。上述数据显示本研究的SLAF-seq测序文库构建正常。从20个短须裂腹鱼样本中共获得80.08百万序列(MReads)数据, 平均Q30(测序正确率为99.9%的碱基比例)为94.79%, 平均GC含量为40.16%, 表明测序质量较高, 测序结果可靠。

2.2　短须裂腹鱼SNP标记开发

从20个短须裂腹鱼样本中共获得709758个SLAF标签, 平均每个样本获得240498个SLAF标签,平均测序深度为95.9 1x; 其中多态性SLAF标签共有243304个。从20个样本的SLAF标签中共鉴别777082个SNP标记, 每个样本获得到409005—564000个SNP标记, 平均每个样本获得515493个SNP标记; 样本中SNP位点的杂合率为20.08%—26.09%, 平均杂合率为24.11%; 样本中SNP位点的完整度(SNP位点在所有样本中的信息完整度)为52.63%—72.57%, 平均完整度为66.33%。根据选择标准, 从获得SNP标记中选择598354个有效SNP进行群体遗传多样性分析, 详见表1。

2.3　群体遗传多样性分析

根据得到的原始SNP计算各遗传多样性参数的平均值, 得到的统计结果是观测等位基因数(Observed allele number)为2.00, 期望等位基因数(Expected allele number)为1.52, 观测杂合度(Observed heterozygosity)为0.20, 期望杂合度(Expected_heterozygosity)为0.31, 多态性信息含量(PIC)为0.25,次要等位基因频率(MAF)为0.23。

2.4　群体聚类与遗传距离分析

Neighbor-joining (Kimura 2-parameter模型,1000次bootstrap)进化树显示20尾短须裂腹鱼样本来源于2个亚群(图1)。

2.5　群体聚类分析

admixture[9]软件分析短须裂腹鱼的群体结构,假设群体的分群数(K值)为1—20, 结果显示K=8时cross-validation errors的数值最大, 表明本研究采集的20尾短须裂鳆鱼样本并非来源于同一群体, 金沙江阿海到龙口江段的短须裂腹鱼群体遗传背景较复杂, 群体间存在混合现象, 这可能是人工增殖放流后和野生资源共存的结果。对聚类结果的交叉验证结果(图2)表明, 当K=1时交叉验证错误率最小, 说明最优分群数为1, 可以推测金沙江阿海到龙口江段的短须裂腹鱼可能来自于同一个原始祖先。

表1　样品SLAF标签和SNP信息统计Tab. 1　SLAF number and SNP information statistics of samples

图1　短须裂腹鱼遗传进化树Fig. 1　The phylogenetic tree of Schizothorax wangchiachii

主成分分析(PCA)是一种纯数学的运算方法,可以将多个相关变量经过线性转换选出较少个数的重要变量, 其结果可以用于与其他聚类方法的结果相互验证。本研究中主成分分析(Principal components analysis, PCA)结果表明20个短须裂腹鱼个体分布在较大的聚类空间上, 部分个体之间的遗传异质性较大(图3、4), 这与admixture软件的分析结果相一致。

2.6　亲缘关系和遗传多样性分析

使用SPAGeDi[11]软件可以对自然群体两两个体间的亲缘关系(Relative kinship)进行估计。亲缘关系本身是定义两特定材料之间的遗传相似度与任意材料之间的遗传相似度的相对值, 因此当结果出现两材料之间的亲缘关系值小于0时, 则直接定义为0[12]。亲缘关系值Kinship的频率分布见图5,20尾短须裂腹鱼样本中, 亲缘关系位于0—0.05的频率较高, 但有少部分样本的Kinship值位于0.05—0.15, 表明20尾短须裂腹鱼样本中多数个体的亲缘关系很近, 小部分样本的亲缘关系相对较远, 这可能是由于繁殖时期洄游后杂交造成的。

图2　短须裂腹鱼Admixture各个K值的交叉验证错误率Fig. 2　The error rate of Schizothorax wangchiachii admixture K value by cross validation

图3　短须裂腹鱼基于前3个主成分的样品聚类图Fig. 3　The error rate of K values for Schizothorax wangchiachii by cross validation

3　讨论

3.1　短须裂腹鱼序列变异位点分析

研究表明, 序列变异位点的转换在鱼类近亲种间出现较频繁, 而颠换则多在较远缘种间发生; 而在同种鱼不同个体间, 转换往往在数量上远超过颠换, 两者比例为5∶1, 甚至高达10∶1[16]。在本研究短须裂腹鱼转换颠换比值(Ti/Tv)均大于1, 说明短须裂腹鱼mtDNA控制区的变异更多的是发生在嘌呤与嘌呤或者嘧啶与嘧啶之间, 而嘌呤与嘧啶或嘧啶与嘌呤之间的颠换则发生得相对较少, 即转换的发生率高于颠换。

3.2　多态性分析

多态信息含量(PIC)反映了位点在群体中的多样性状况, 一般认为 PIC＞0.5时为高度多态性位点,0.25＜PIC＜0.5时为中度多态性位点, PIC＜0.25时为低度多态性位点[17,18]。本研究中多态信息含量0.2562, 表明所选的个位点均为中度多态性位点, 多态性高; 期望等位基因数为1.5272, 观测等位基因数为2.0050, 表明其等位基因分布均匀。适合短须裂腹鱼的遗传多样性研究。

3.3　遗传多样性分析

杂合度的高低反映了群体遗传一致性的程度,基因杂合度又称为基因多样度, 是度量群体遗传变异的最合适参数之一, 其位点的平均杂合度近似反映了群体遗传变异程度的高低[19,20]。杂合度越高的生物群体变异越大, 对环境变化和自然选择的适应能力也越强[21,22], 在本研究中观测杂合度和期望杂合度均值为0.2007和0.3160, 相比同为同一水系同为鲤科的金沙江观音岩段圆日铜鱼(均值为0.8520和0.8383)[23]以及长江水系岩元、攀枝花、宜宾、合江、木洞、宜昌的圆口铜鱼群体(均值为0.8593和0.8405)[24]多态性较低。

多样性指数是群落丰度的指标, 指数越高, 该群落越稳定(种群间联系越紧密, 越多样); 香浓指数是用来反应群体的多样性的高低, 指数越大, 多样性越高。本研究短须裂腹鱼多样性指数为0.3386,香浓指数为0.4827, 观测杂合度远低于期望杂合度,说明该江段短须裂腹鱼群体的变异程度不高, 对环境变化和自然选择能力不强; 多样性指数较低, 说明该群体较不稳定; 香浓指数表明, 群体的多样性偏低。整体分析表明, 该江段的短须裂腹鱼群体处于较低的遗传多样性水平, 可能降低了其对环境变化的应对能力与适应能力。

图4　短须裂腹鱼样品聚类结果Fig. 4　Sample clustering results of Schizothorax wangchiach

图5　短须裂腹鱼亲缘关系图Fig. 5　Genetic relationship figure of Schizothorax wangchiachii

参考文献：

[1]Qu J J, Yu M, Dong L, et al. Applications of SNP in animal and plant genetic breeding [J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2011, 42(12)： 9—13 [曲娟娟, 于敏, 董蕾, 等. SNP在动植物遗传育种中的应用. 东北农业大学学报, 2011, 42(12)： 9—13]

[2]Chu X L, Chen Y R. The Fauna of Fishes from Yunnan：the first volume [M]. Beijing： Academic Press. 1989,296—297 [褚新洛, 陈银瑞. 云南鱼类志： 上册. 北京： 科学出版社. 1989, 296—297]

[3]Liu Y T, Leng Y, Xu W Y, et al. The primary exploration of Schizothorax wangchiachii artificial propagation[J]. Reservoir Fisheries, 2007, 27(5)： 31—32 [刘跃天, 冷云, 徐伟毅, 等. 短须裂腹鱼人工繁殖初探. 水利渔业,2007, 27(5)： 31—32]

[4]Xu W Y, Leng Y, Liu Y T, et al. Research on Schizothorax wangchiachii domestication culture trial [J]. Reservoir Fisheries, 2003, 23(3)： 16—17 [徐伟毅, 冷云, 刘跃天, 等. 短须裂腹鱼驯化养殖试验研究. 水利渔业, 2003,23(3)： 16—17]

[5]Liang X. The behavior research on the wild juvenile Schizothorax wangchiachii [J]. Modern Agricultural Science and Technology, 2011, (5)： 321—322 [梁祥. 野生短须裂腹鱼幼鱼行为学研究. 现代农业科技, 2011, (5)：321—322]

[6]Zuo P X, Li G H, Leng Y, et al. Embryonic and Early Larval Development of Schizothorax wangchiachii [J].Journal of Hydroecology, 2015, 36(3)： 77—82 [左鹏翔,李光华, 冷云, 等. 短须裂腹鱼胚胎与仔鱼早期发育特性研究. 水生态学杂志, 2015, 36(3)： 77—82]

[7]Xiao M S, Cui F, Kang J. Genetic structure and variation of wild Ophicephalus argus cantor from Huaihe River based on MtDNA D-loop sequences [J]. Journal of Huazhong Normal University (Natural Science), 2009,47(1)： 82—90 [肖明松, 崔峰, 康健. 淮河乌鳢线粒体DNA控制区结构分析及遗传多样性研究. 华中师范大学学报： 自然科学版, 2009, 47(1)： 82—90]

[8]Koichiro T, Daniel P, Nicholas P. MEGA5： Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood,evolutionary distance, and maximum parsimony methods[J]. Molecular Biology and Evolution, 2011, 28(10)：2731—2739

[9]Alexander D H, Novembre J, Lange K. Fast model-based estimation of ancestry in unrelated individuals [J]. Genome Research, 2009, 19(9)： 1655—1664

[10]Price A L, Patterson N J, Plenge R M, et al. Principal components analysis corrects for stratification in genomewide association studies [J]. Nature Genetics, 2006,38(8)： 904—909

[11]Hardy O J, Vekemans X. SPAGeDi： a versatile computer program to analyse spatial genetic structure at the individual or population levels [J]. Molecular Ecology Notes,2002, 2(4)： 618—620

[12]Su W J, Zhao N, Lei J, et al. SNP sites developed by specific length amplification fragment sequencing (SLAF-seq) in sweet potato [J]. Scientia Agricultura Sinica,2016, 49(1)： 27—34 [苏文瑾, 赵宁, 雷剑, 等. 基于SLAF-seq技术的甘薯SNP位点开发. 中国农业科学,2016, 49(1)： 27—34]

[13]Li H, Durbin R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform [J]. Bioinformatics,2009, 25(14)： 1754—1760

[14]McKenna A, Hanna M, Banks E, et al. The Genome Analysis Toolkit： a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data [J]. Genome Research, 2010, 20(9)： 1297—1303

[15]Li H, Handsaker B, Wysoker A, et al. The sequence alignment/map format and SAMtools [J]. Bioinformatics,2009, 25(16)： 2078—2079

[16]Meyer A, lson. Origin of tetrapods inferred from their mitochondrial DNA affiliation to lungfish [J]. Journal of Molecular Evolution, 1990, 31(5)： 359—364

[17]Hou N, Zhang Y, Lu C Y, et al. Genetic potential analysis of Germany mirror carp (Cyprinus carpio L.) using micro satellite markers [J]. Hereditas (Beijing), 2007,29(12)： 1509—1518 [侯宁, 张研, 鲁翠云, 等. 微卫星DNA标记分析德国镜鲤的遗传潜力. 遗传, 2007,29(12)： 1509—1518]

[18]Wright. Evolution and the Genetics of Populations [M].Chicago： University of Chicago Press. 1978

[19]Nei M. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals [J]. Genetics,1978, 89(3)： 583—590

[20]Nei M, Maruyama T, Chakraborty R. The bottleneck effect and genetic variability in populations [J]. Evolution,1975, 29(1)： 1—10

[21]Beardmore J A, Mair G C, Lewis R I. Biodiversity in aquatic systems in relation to aquaculture [J]. Aquaculture Research, 1997, 28(10)： 829—839

[22]Xu Z, Primavera J P, Pena L D, et al. Genetic diversity of wild and cultured Black Tiger Shrimp (Penaeus monodom) in the Philippines using microsatellites [J]. Aquaculture, 2001, 199(1-2)： 13—40

[23]Wang W, Zhou Q, Zhang S L, et al. Micro satellite genetic diversity analysis of the Coreius guichenoti in the Guanyinyan section of Jinsha River [J]. Freshwater Fisheries, 2015, 46(6)： 22—26 [王伟, 周琼, 张沙龙, 等. 金沙江观音岩段圆日铜鱼的微卫星遗传多样性分析. 淡水渔业, 2015, 46(6)： 22—26]

[24]Yuan X P, Yan L, Xu S Y, et al. Genetic diversity of bronze gudgeon (Coreius heterodon) and largemouth bronze gudgeon (C. guichenoti) in Yangtze River Basin[J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2008, 15(3)：377—385 [袁希平, 严莉, 徐树英, 等. 长江流域铜色和圆口铜色的遗传多样性. 中国水产科学, 2008, 15(3)：377—385]