亚麻籽油和豆油替代鱼油对大黄鱼肝脏和肌肉脂肪酸组成及Δ6Fad基因表达的影响

李经奇　李学山　姬仁磊　徐　玮　麦康森　艾庆辉

(中国海洋大学教育部海水养殖重点实验室, 农业部海水养殖重点实验室, 青岛 266003)

长链多不饱和脂肪酸(Long chain-polyunsaturated fatty acid; LC-PUFA)如DHA (22：3n-6)和EPA(20：3n-5)已被证实在神经系统发育、心脑血管疾病和抗炎等生理过程中发挥着重要的作用[1—7], 目前脊椎动物获得LC-PUFA的途径有2种方式, 一是从直接从食物中摄取, 二是以18碳链的不饱和脂肪酸(如亚油酸18：2n-6和亚麻酸18：3n-3)为前体通过一系列去饱和及延长反应自身生物合成[6]。对于鱼类, 尤其是海水鱼类, 从食物中获取LC-PUFA是其满足自身生理需求的重要途径。鱼油中富含HUFA,是水产饲料中重要的脂肪源, 但随着水产养殖业的迅猛发展和鱼油资源的短缺, 不平衡的供需关系导致产量高、价格相对低廉的植物油逐渐替代鱼油成为饲料中的主要脂肪源。与淡水鱼不同, 海水鱼需要从食物中获取外源LC-PUFA以满足其正常生长、存活和生理功能的需要[8,9], 表明了海水鱼类合成LC-PUFA的能力较弱[10,11]。由于植物油不含有EPA和DHA, 当植物油高比例替代鱼油, 会导致海水鱼无法获得足够的LC-PUFA, 而对其生长和代谢产生不利的影响。在这种情况下, 通过自身合成就成为海水鱼获得能够满足其生理需求的LC-PUFA的最重要的途径。

脊椎动物进行LC-PUFA生物合成过程是通过脂肪酸去饱和酶(Fads)和延长酶(Elovl)催化完成的,经过连续的去饱和及延长反应, 将亚油酸(18：2n-6)和亚麻酸(18：3n-3)合成为DHA和EPA等高不饱和脂肪酸[12]。研究表明, Δ6Fad是亚油酸(18：2n-6)和亚麻酸(18：3n-3)合成LC-PUFA过程中的限速酶[13],Δ6Fad的活性的高低决定了合成LC-PUFA能力的高低。大量的研究表明, 脂肪酸能够调控Δ6Fad基因表达和活性。研究发现, 鲤(Cyprinus carpio)细胞培养过程中缺乏PUFA, 会促进PUFA的合成[14], 植物油替代鱼油也会造成大西洋鲑(Salmo salar)肝脏和肠的Δ6Fad基因的表达量上调, 同时也增强了其自身合成LC-PUFA的能力[15—17], 董小敬[18]对大黄鱼、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)和鲈(Lateolabrax japonicus)的研究表明混合植物油逐渐替代鱼油上调了Δ6Fad基因的表达量。

大黄鱼(Larimichthys crocea)是目前我国产量最大的海水养殖鱼类, 具有较高的经济价值, 但植物油高比例替代鱼油的配合饲料的使用导致了鱼体中的LC-PUFA含量下降, 营养品质下降。本实验旨在探究用富含亚油酸的豆油和富含亚麻酸的亚麻籽油替代鱼油对大黄鱼肝脏和肌肉中脂肪酸组成和Δ6Fad基因表达的影响, 以期为提高海水鱼的LC-PUFA合成能力提供理论基础。

1　材料与方法

1.1　实验饲料

以酪蛋白和明胶为主要蛋白源, 亚麻籽油和豆油完全替代鱼油, 制成3种等氮等脂的精制饲料, 分别以FO、LO和SO表示(表1、表2)。原料粉碎后过80目筛, 梯度混合均匀, 混匀后与卵磷脂和油源充分混合, 添加适量的水, 混合并过40目筛, 充分混匀后上机制粒, 恒温风箱55℃烘干10h, 待冷却后置于-20℃保存待用。

1.2　养殖实验和样品采集

养殖实验在福建省宁德市国家级大黄鱼良种场所属的海水浮动网箱(2 m×2 m×2.5 m)中进行, 为期10周, 实验开始前, 实验用鱼被暂养(2周)在网箱(4 m×4 m×2.5 m)中, 暂养期间投喂对照组饲料, 每天饱食投喂两次(6：00和17：00), 使之适应养殖环境和饲料。实验开始前, 将鱼饥饿24h, 然后用MS-222(100 mg/L)将鱼麻醉, 选择规格均匀体表无损伤的鱼[平均体重(15.42±0.01) g], 随机分配到12个网箱中, 每个网箱放入大黄鱼120尾, 每个处理4个重复, 每天记录水温和水质指标以及死鱼的重量和数量。实验期间水温在24—28℃, 盐度在26‰—29‰,pH 7.4—7.8, 溶解氧在6—7 mg/L。

在样品采集前, 所有实验用鱼饥饿24h, 用MS-222 (100 mg/L)将鱼麻醉, 对每个网箱中的鱼进行称重计数, 从每个网箱中随机挑选6尾鱼, 静脉取血后于冰上解剖取出肝脏和肌肉样品放入1.5 mL的无RNA酶的离心管, 并迅速放到液氮中, 最后转移到-80℃冰箱保存, 用于后续的实验。3尾鱼的组织样品用于Δ6Fad mRNA表达量的检测, 另外3尾鱼的组织样品用于脂肪酸的检测。

1.3　脂肪酸的提取和分析

脂肪酸样品处理使用HCl-甲醇法, 具体步骤参照李松林[20]：(1) 取湿重1 g左右组织样品, 剪碎并放入10 mL离心管中, 于冷冻干燥机中冷冻干燥过夜; (2) 配制1 N的KOH-甲醇溶液和3N的HCl-甲醇溶液。(3) 取100 mg冷冻干燥后的组织样品放入10 mL的脂肪酸处理专用玻璃管中, 加入3 mL KOH-甲醇溶液, 密封, 78℃水浴20min, 冷却至室温, 然后加入3 mL的HCl-甲醇溶液, 密封, 78℃水浴20min, 冷却至室温, 然后加入1 mL的色谱级正己烷, 稍振荡, 于暗处密封放置过夜。(4) 加入1 mL的水使分层, 小心取上清于2 mL进样瓶中, 用于保存或直接用于检测。

脂肪酸的检测使用HP6890气相色谱仪(Aligents Technologies)进行检测, 色谱柱为石英毛细管柱(Hewlett Packard, Palo Alto, CA), 火焰电离检测器进行检测, 按照如下程序升温; 柱温首先升温至150℃, 1min, 然后以15℃/min升至200℃, 之后以2℃/min升至250℃。

表1　实验饲料配方以及化学组成(%干物质)Tab. 1　Formulation and chemical proximate composition of the experimental diets (% dry matter)

1.4　cDNA合成和实时荧光定量PCR

组织样品在液氮中研磨后, 用Trizol法提取mRNA, 用NanoDrop-2000光谱仪(Thermo SCIENTIFIC, USA)测定mRNA的浓度和质量, 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测mRNA的完整性。用Prime ScriptTMRT试剂盒(TaKaRa, Japan)将提取的mRNA转录成cDNA。其中： 12.5 μL 2×SYBR Premix Ex TaqTMII, 1 μL上游引物(F： TTCGCTTCCTCTGCT GCTATG)(10 μmol/L), 1 μL下游引物(R： CCAGT CACGGTGCTTCTCG)(10 μmol/L), 1 μL cDNA(稀释到80 ng/μL), 9.5 μL的双蒸水, PCR的反应条件为： 95℃ 2min, 1个循环; 95℃ 15s, 60℃ 15s, 72℃20s, 40个循环。PCR反应在Eppendorf Mastercycler gradient (Eppendorf, German)中进行。

表2　饲料脂肪酸组成(%总脂肪酸)Tab. 2　Diet fatty acids composition (% total fatty acid)

1.5　数据处理分析

实时荧光定量PCR的数据处理采用2-ΔΔCt法进行计算(ΔΔCt=ΔCt目的基因-ΔCt内参基因)。结果使用SPSS19.0统计软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA), 当结果达到显著差异(P＜0.05)时, 采用Tukey’s检验进行多重比较或t-test, 数据用平均值±标准误表示。

2　结果

2.1　亚麻籽油和豆油对大黄鱼生长和饲料效率的影响

实验结果表明, 亚麻籽油和豆油替代鱼油显著降低了大黄鱼的增重率、饲料效率和特定生长率(P＜0.05), 在亚麻籽油和豆油组之间差异不显著(P＞0.05)。亚麻籽油和豆油全替代鱼油降低了大黄鱼的存活率, 豆油组的存活率显著低于鱼油组(P＜0.05), 亚麻籽油组与鱼油组和豆油组没有显著差异(P＞0.05)。亚麻籽油和豆油替代鱼油造成肝体指数和脏体指数有上升的趋势, 但各组间差异不显著(P＞0.05)(表3)。

2.2　大黄鱼肝脏和肌肉中脂肪酸组成

实验结果表明, 亚麻籽油和豆油替代鱼油显著改变了大黄鱼肝脏和肌肉中的脂肪酸组成。在大黄鱼的肝脏中, 植物油替代鱼油显著降低了饱和脂肪酸(SFA)、20：4n-6(ARA)和n-3LC-PUFA的相对含量(P＜0.05), 但在植物油替代组中没有出现显著差异(P＞0.05)。在亚麻籽油替代组(LO)中, 18：3n-3(LNA)的相对含量显著高于鱼油组(FO)和豆油组(SO)(P＜0.05), 而FO组和SO组之间差异不显著(P＞0.05)。18：2n-6(LA)和n-6PUFA的相对含量在豆油(SO)组中显著高于FO组和LO组(P＜0.05), FO组显著低于LO组(P＜0.05)。单不饱和脂肪酸在各组间没有显著差异(P＞0.05)。在大黄鱼肌肉中, LO组和SO组的SFA和n-3LC-PUFA显著低于FO组(P＜0.05), ARA相对含量在SO组显著低于FO组(P＜0.05), LO组和其他2组没有显著差异(P＞0.05)。18：2n-6和n-6PUFA在不同处理的肌肉中的相对含量在豆油(SO)组中显著高于FO组和LO组(P＜0.05),FO组显著低于LO组(P＜0.05)。18：3n-3的相对含量在FO组中显著低于豆油组和亚麻籽油组(P＜0.05),豆油组显著低于亚麻籽油组(P＜0.05)(表4)。

表3　饲料脂肪酸对大黄鱼生长和饲料利用的影响Tab. 3　Effects of dietary lipids on growth and feed utilization of large yellow croaker

对相同处理组中的肝脏和肌肉PUFA相对含量进行分析发现, 在各处理组中, 肌肉中的ARA、EPA和DHA的相对含量显著高于肝脏(P＜0.05)。在鱼油组中, 肌肉的LNA和LA的相对含量要高于肝脏(P＞0.05), 但在亚麻籽油组和豆油组中, 肌肉中的LNA和LA的相对含量要低于肝脏(P＞0.05)(图1)。

2.3　亚麻籽油和豆油替代鱼油对Δ6Fad基因表达量的影响

亚麻籽油和豆油显著上调了大黄鱼肝脏和肌肉中Δ6Fad的基因表达量(P＜0.05), 其表达量在肝脏中分别升高了7.6和6.5倍, 在肌肉中分别上升了2.2和2.8倍。在亚麻籽油和豆油组中没有显著差异(P＞0.05)(图2)。

3　讨论

本实验结果显示, 经过10周的养殖实验后, 亚麻籽油组和豆油组的大黄鱼的增重率和特定生长率显著降低, 这表明当亚麻籽油和豆油完全替代鱼油后, 大黄鱼不能很好的利用亚麻籽油和豆油, 从而对其生长产生了不利影响。这与在泥鳅( Misgurnus anguillicaudatus )的研究结果[21]不同。高坚等[21]的研究结果表明, 当用鱼油、大豆油、玉米油、花生油和棕榈油饲料饲喂泥鳅40d后, 其生长性能没有显著差异。彭墨等[22]的研究表明, 当菜籽油全替代鱼油后, 经过92d饲喂, 大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)幼鱼的终末体重和特定生长率显著降低。出现这种结果的原因可能是因为泥鳅是淡水鱼类, 大黄鱼是海水鱼类, 而淡水鱼类利用植物油的能力要强于海水鱼类[23]。

表4　饲料脂肪源对大黄鱼肝脏和肌肉脂肪酸组成的影响(%总脂肪酸)Tab. 4　Effect of dietary lipids on liver and muscle fatty acid composition of large yellow croaker (% total fatty acid)

图1　相同处理组中大黄鱼肝脏、肌肉及饲料的脂肪酸组成(%总脂肪酸)Fig. 1　Fatty acid composition in liver, muscle of large yellow croaker under each diet (% total fatty acid)

图2　大黄鱼肝脏和肌肉的Δ6Fad基因的表达量Fig. 2　The gene expression of Δ6Fad of large yellow croaker

植物油替代鱼油会影响鱼体脂肪酸组成[24], 进而影响鱼体的品质[25]和相关代谢。植物油由于不含LC-PUFA, 当植物油替代鱼油时会造成鱼体LCPUFA的含量下降和LC-PUFA相关代谢基因的变化[26]。对大黄鱼、虹鳟和鲈的研究表明[18], 随着植物油替代鱼油的比例升高, 其DHA和EPA的相对含量显著下降。对尖吻鲷(Diplodus puntazzo)[27]的研究表明, 大豆油和亚麻籽油替代鱼油导致了肝脏中LC-PUFA相对含量的下降, 对大菱鲆[22]、赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)[28]和大西洋鲑(Salmo salar)[29]的研究也具有同样的结果。本研究通过使用亚麻籽油和豆油完全替代鱼油制备的精制饲料饲喂大黄鱼, 结果发现, 亚麻籽油和豆油替代鱼油降低了大黄鱼肝脏和肌肉的ARA、EPA和DHA的相对含量, LNA和LA相对含量升高, 组织脂肪酸组成反映了饲料脂肪酸组成, 与在尖吻鲷[27]、虹鳟[30]和大黄鱼[19]的结果一致。

对肝脏和肌肉在相同处理组中的脂肪酸组成进行分析发现, 在所有处理组中, ARA、EPA和DHA在肌肉中的相对含量均显著高于肝脏, 但在亚麻籽油组和豆油组中肌肉的LA和LNA的相对含量均低于肝脏, 这与鲈的研究结果相一致[23]。造成这种现象的原因可能是, 一方面, 肝脏合成的LCPUFA可能通过脂肪酸转运途径转运至肌肉中; 一方面, 肌肉可能利用LNA和LA来合成LC-PUFA; 另一方面, 肌肉组织是氧化供能的主要组织, 而LNA被证明主要被用来进行β氧化供能[31]。

鱼类由于缺乏Δ12和Δ15去饱和酶, 所以无法从头合成LC-PUFA, 只能通过摄食饲料中的亚麻酸和亚油酸进行体内合成LC-PUFA, Δ6Fad是LCPUFA合成过程中的关键酶, 饲料中脂肪酸的组成变化会对其基因表达产生影响, 鱼油富含LC-PUFA,如DHA和EPA, LC-PUFA会抑制Δ6Fad基因的表达[32], 相应的, 用不含LC-PUFA的植物油替代鱼油会导致饲料中LC-PUFA含量下降, 则会上调Δ6Fad基因的表达[16—18,26]。本研究发现大黄鱼肝脏和肌肉的Δ6Fad基因的表达量在豆油组和亚麻籽油组显著升高, 这结果与金头鲷(Sparus aurata)[33]和大西洋鲑[26,34]的结果相同, 发现随着植物油替代鱼油会上调Δ6Fad基因。这表明了饲料脂肪酸的组成的变化会影响机体合成LC-PUFA的能力。对大黄鱼的肝脏和肌肉的Δ6Fad基因表达量进行分析发现, 植物油替代鱼油后, 肝脏中Δ6Fad基因转录水平的变化较肌肉更为显著, 表明了与肌肉相比, 肝脏能够更敏感的响应饲料脂肪酸, 可能是更为重要的LC-PUFA合成的部位。

综上所述, 豆油和亚麻籽油替代鱼油对鱼类的生长产生了不利影响, 改变了鱼体肌肉和肝脏脂肪酸组成, 降低了LC-PUFA的含量, 但显著上调了Δ6Fad基因的表达, 与肌肉组织相比, 肝脏中Δ6Fad基因能够更显著的响应组织中脂肪酸的变化。

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