急性白血病患者骨髓单个核细胞中芳香烃受体和色氨酸二加氧酶mRNA的表达

裴晓杭，张 茵，陈香丽，陈玉清，牛晓娜，张文荟

(河南省人民医院血液科，河南 郑州 450003)

急性白血病(acute leukemia，AL)是一种来源于多能干细胞或早期祖细胞(髓系及淋系)的造血系统恶性肿瘤。在外源性毒物中苯是唯一较为明确的可致人类白血病的化学物质[1]。研究发现，人类造血干细胞通过芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor，AHR)来维持其静息、增殖及衰老[2]。苯等芳香烃类物质是AHR的外源性配体。色氨酸二加氧酶(tryptophan 2，3-dioxygenase，TDO)是犬尿酸通路的首要限速酶之一，可将左旋色氨酸转化为更稳定的犬尿氨酸(kynurenine，KYN)[3]。TDO广泛表达于多种肿瘤细胞，并与人体抗肿瘤免疫应答的减低有关[4]。OPITZ等[5]于2011年首次报道，在人类颅脑肿瘤中KYN可作为AHR的内源性配体，通过 TDO-KYN-AHR通路抑制肿瘤免疫反应，促进肿瘤细胞生长和转移，而且与肿瘤的进展和不良预后有关。目前尚无研究报道TDO、KYN及AHR在AL中的作用及其相关性。本研究通过观察AHR mRNA和TDO mRNA在AL患者骨髓单个核细胞中的表达水平，并分析其相关性，旨在探讨AL的发病机制。

1 资料与方法

1.1一般资料选择2013年8月至2014年8月河南省人民医院收治的初诊AL患者65例为观察组，男38例，女27例，年龄16～83岁，中位年龄33岁，患者均符合法美英合作组(French-American-British cooperative group，FAB)关于AL的诊断标准[6]，其中急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)50例，急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)15例。MAL患者中男30例，女20例，年龄10～70岁，中位年龄40岁；ALL患者中男10例，女5例，年龄12～51岁，中位年龄39岁。另选择同期因贫血就诊的排除血液系统恶性疾病患者15例为对照组，其中男9例，女6例，年龄15～65岁，中位年龄36岁。AML、ALL及对照组患者的性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究方案经河南省人民医院伦理委员会批准，所有研究对象签署知情同意书。

1.2主要试剂与仪器实时荧光定量反转录聚合酶链式反应(real time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，RQ-RT-PCR)仪购自美国应用生物系统公司，淋巴细胞分离液购自上海生工生物工程有限公司，RNA提取试剂盒、RNA反转录试剂盒、聚合酶链反应试剂盒均购自美国Invitrogen公司。引物及探针序列由上海生工生物工程有限公司合成，AHR扩增片段为 183 bp，TDO扩增片段为192 bp。以β-actin作为内参照，扩增片段为179 bp。AHR上游引物序列为5′-AACAGATGAGGAAGGAACAGAGC-3′，下游引物序列为5′-CTTAGAGTGGATGTGGTAGCAGAG-3′；TDO上游引物序列为5′-TAGAGCCAGCAAAGGAGGTC-3′，下游引物序列为5′-TTGGCAGAATTGAGTGCCTA-3′；管家基因actin上游引物序列为5′-ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3′，下游引物序列为5′-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′。

1.3骨髓采集及处理在无菌环境下，于初诊时抽取观察组及对照组患者髂后上嵴骨髓标本2 mL，乙二胺四乙酸二钠盐抗凝后于4 ℃冰箱保存，备用。

1.4RQ-RT-PCR检测骨髓单个核细胞中AHRmRNA及TDOmRNA相对表达量取骨髓液 2 mL 混匀，用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，按照RNA提取试剂盒说明书提取总RNA。最后加入30 μL 无RNA酶水进行溶解，并测定样品总RNA。采用反转录试剂盒将提取的RNA反转录为cDNA。PCR反应体系：上、下游引物各0.4 μL，Taq聚合酶10 μL，模板2 μL，双蒸水7.2 μL。PCR条件：95 ℃ 30 s，1个循环；95 ℃ 5 s，60个循环；60 ℃ 33 s，40个循环。扩增目的基因的同时扩增GAPDH基因。反应结束后即可从RQ-PCR仪上直接获得所需数据。采用相对定量法分析2组患者骨髓单个核细胞中AHR mRNA及TDO mRNA的相对表达量，靶基因的相对表达量采用2-△△Ct法计算。

1.5统计学处理应用SPSS 20.0软件进行分析，mRNA表达量为非正态分布计量资料，采用中位数(四分位数间距)表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验和Kruskal-WallisH检验，相关性分析采用Spearman检验；P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.12组患者骨髓单个核细胞中TDOmRNA、AHRmRNA表达水平比较结果见表1。观察组中AML患者和ALL患者的骨髓单个核细胞中TDO mRNA、AHR mRNA表达显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。AML患者与ALL患者骨髓单个细胞中TDO mRNA、AHR mRNA表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1初诊AL患者骨髓单个核细胞中TDO和AHRmRNA表达水平

Tab.1ComparisonoftheexpressionofTDOmRNAandAHRmRNAinbonemarrowmononuclearcellsofpatientswithnewlydiagnosedAL

中位数(四分位数间距)

注：与对照组比较aP<0.05。

2.2AML、ALL患者骨髓单个核细胞中TDOmRNA与AHRmRNA的相关性AML和ALL患者骨髓单个核细胞中TDO mRNA与AHR mRNA表达均呈显著正相关(r=0.801、0.922，P<0.05)。

2.3TDOmRNA、AHRmRNA与临床实验室指标的相关性50例初诊AML患者的外周血白细胞计数为(52.9±18.3)×109L-1，血红蛋白水平为(84.2±20.2)g·L-1，血小板计数为(49.0 ±23.0)×109L-1，乳酸脱氢酶水平为(1 055.5±530.4)U·L-1；15例初诊ALL患者的外周血白细胞计数为(80.9±10.6)×109L-1，血红蛋白含量为(71.2±25.3)g·L-1，血小板计数为(30.0±21.0)×109L-1，乳酸脱氢酶水平为(2 043.5±660.4)U·L-1。线性相关分析显示，白细胞计数、血小板计数、血红蛋白及乳酸脱氢酶水平与TDO mRNA及AHR mRNA的表达均无显著相关性(P>0.05)，见表2。

表2TDOmRNA、AHRmRNA与临床实验室指标的相关性

Tab.2CorrelationbetweentheexpressionofTDOmRNA，AHRmRNAandclinicallaboratoryindexesofALpatients

疾病类型nTDOmRNArPAHRmRNArPAML50 白细胞计数-0.1520.589-0.2310.408 乳酸脱氢酶-0.3050.269-0.2990.278 血红蛋白0.0490.8620.1000.722 血小板计数-0.0150.958-0.0370.896ALL15 白细胞计数-0.1910.1830.0090.950 乳酸脱氢酶-0.1420.325-0.1150.428 血红蛋白0.0120.9310.0140.922 血小板计数-0.0290.843-0.0920.526

3 讨论

AHR是基本螺旋-环-螺旋转录因子家族中的一员，在细胞质中可被其内、外源性配体激活，移位到细胞核内，并与AHR核转运蛋白形成异二聚体复合物，此异二聚体可结合于相应的DNA序列即AHR反应元件，引发下游靶基因的转录和表达，产生一系列生物学效应[7]。AHR异常表达与肿瘤的发生密切相关[8]。多环芳香烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAH)类物质是一类毒性极高的环境持续污染物，当动物和人类偶然暴露于有毒的PAH时，PAH可与AHR结合后进入细胞核，形成异二聚体，诱发多种肿瘤[9]。研究表明，在缺乏环境型外源性配体PAH的情况下，AHR在很多肿瘤细胞如乳腺癌、肺腺癌、胃癌、成人T淋巴细胞淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌、尿路上皮癌、神经胶质瘤和髓母细胞瘤中也是活跃和高表达的[10-17]，以上研究显示，AHR不仅存在外源性配体，也存在相应的内源性配体，在外源性配体缺乏的情况下，内源性配体激活AHR，从而诱发肿瘤。

已发现KYN为AHR的内源性配体[18]，在人类脑肿瘤中，色氨酸经TDO降解为KYN，KYN作为内源性配体与其肿瘤细胞表达的AHR结合，由细胞质进入细胞核，促使肿瘤细胞恶性增殖和侵袭[6]。KYN激活AHR以一种自分泌或旁分泌的方式促进肿瘤生长[19]。CASADO等[20]研究认为，AHR通过产生调节异常的AHR信号和扰乱造血微环境参与了造血细胞的调节，并促进了包括AL在内的血液系统疾病的发生和发展。本研究对50例AML患者和15例ALL患者的AHR mRNA表达进行检测，AHR mRNA在AML患者和ALL患者中的表达均高于对照组，与CASADO等[20]研究一致，说明AHR mRNA的表达在AL的发生、发展中起到了重要作用。

KYN作为激活AHR的内源性配体，在细胞内主要由色氨酸转化而来，参与色氨酸代谢的主要限速酶有吲哚胺2，3双加氧酶和TDO。ADAMS等[21]研究显示，人类神经胶质瘤中的TDO-KYN-AHR通路是激活的，TDO mRNA和AHR mRNA在神经胶质瘤细胞中高表达。本研究显示，TDO mRNA及AHR mRNA在AML和ALL患者骨髓单个核细胞中的表达均高于对照组，且AML、ALL患者骨髓单个核细胞中TDO mRNA与AHR mRNA的表达均呈显著正相关，提示TDO-KYN-AHR通路不仅存在于人类神经胶质瘤细胞中，也存在于AL患者。但进一步分析显示，AML、ALL患者的TDO mRNA、AHR mRNA表达与白细胞计数、血红蛋白含量、血小板计数及乳酸脱氢酶水平等无显著相关性，推测可能与样本量小有关，进一步研究须在扩大样本量的基础上进行。

综上所述，TDO和AHR在AL患者骨髓单个核细胞中呈高表达，TDO-KYN-AHR通路可能促进了AL的发生、发展，为免疫靶向治疗TDO和AHR的靶点选择提供了参考。

[1] 李君，王茂生，杨淑莲，等.急性白血病1 040例临床类型及发病相关因素构成比分析[J].临床血液学杂志，2011，24(3)：178-179.

[2] GASIEWICZ T A，SINGH K P，CASADO F L.The aryl hydrocarbon receptor has an important role in the regulation of hematopoiesis：implications for benzene-induced hematopoietic toxicity[J].ChemBiolInteract，2010，184(1/2)：246-251.

[3] MENG B，WU D，GU J，etal.Structural and functional analyses of human tryptophan 2，3-dioxygenase[J].Proteins，2014，82(11)：3210-3216.

[4] PILOTTE L，LARRIEU P，STROOBANT V，etal.Reversal of tumoral immune resistance by inhibition of tryptophan 2，3-dioxygenase[J].ProcNatlAcadSciUSA，2012，109(7)：2497-2502.

[5] OPITZ C A，LITZENBURGER U M，SAHM F，etal.An endogenous tumour-promoting ligand of the human aryl hydrocarbon receptor[J].Nature，2011，478(7368)：197-203.

[6] 陆亚岚，陈世明，汪玉芳，等.老年急性白血病患者染色体核型异常与FAB分型及预后的关系[J] 新乡医学院学报，2015，32(9)：844-846.

[7] STEVENS E A，MEZRICH J D，BRADFIELD C A.The aryl hydrocarbon receptor：a perspective on potential roles in the immune system[J].Immunology，2009，127(3)：299-311.

[8] GASIEWICZ T A，HENRY E C，COLLINS L L.Expression and activity of aryl hydrocarbon receptors in development and cancer[J].CritRevEukaryotGeneExpr，2008，18(4)：279-321.

[9] PUGA A，MA C，MARLOWE J L.The aryl hydrocarbon receptor cross-talks with multiple signal transduction pathways[J].BiochemPharmacol，2009，77(4)：713-722.

[10] YANG X，SOLOMON S，FRASER L R，etal.Constitutive regulation of CYP1B1 by the aryl hydrocarbon receptor(AhR) in pre-malignant and malignant mammary tissue[J].JCellBiochem，2008，104(2)：402-417.

[11] PENG T L，CHEN J，MAO W，etal.Potential therapeutic significance of increased expression of aryl hydrocarbon receptor in human gastric cancer[J].WorldJGastroenterol，2009，15(14)：1719-1729.

[12] HAYASHIBARA T，YAMADA Y，MORI N，etal.Possible involvement of aryl hydrocarbon receptor(AhR) in adult T-cell leukemia(ATL) leukemogenesis：constitutive activation of AhR in ATL[J].BiochemBiophysResCommun，2003，300(1)：128-134.

[13] KOLIOPANOS A，KLEEFF J，XIAO Y，etal.Increased arylhydrocarbon receptor expression offers a potential therapeutic target for pancreatic cancer[J].Oncogene，2002，21(39)：6059-6070.

[14] GLUSCHNAIDER U，HIDAS G，COJOCARU G，etal.β-TrCP inhibition reduces prostate cancer cell growth via upregulation of the aryl hydrocarbon receptor[J].PLoSOne，2010，5(2)：e9060.

[15] ISHIDA M，MIKAMI S，KIKUCHI E，etal.Activation of the aryl hydrocarbon receptor pathway enhances cancer cell invasion by upregulating the MMP expression and is associated with poor prognosis in upper urinary tract urothelial cancer[J].Carcinogenesis，2010，31(2)：287-295.

[16] GRAMATZKI D，PANTAZIS G，SCHITTENHELM J，etal.Aryl hydrocarbon receptor inhibition downregulates the TGF-β/Smad pathway in human glioblastoma cells[J].Oncogene，2009，28(28)：2593-2605.

[17] DEVER D P，OPANASHUK L A.The aryl hydrocarbon receptor contributes to the proliferation of human medulloblastoma cells[J].MolPharmacol，2012，81(5)：669-678.

[18] NGUYEN L P，BRADFIELD C A.The search for endogenous activators of the aryl hydrocarbon receptor[J].ChemResToxicol，2008，21(1)：102-116.

[19] ANDERSSON P，MCGUIRE J，RUBIO C，etal.A constitutively active dioxin/aryl hydrocarbon receptor induces stomach tumors[J].ProcNatlAcadSciUSA，2002，99(15)：9990-9995.

[20] CASADO F L，SINGH K P，GASIEWICZ T A.The aryl hydrocarbon receptor：regulation of hematopoiesis and involvement in the progression of blood diseases[J].BloodCellsMolDis，2010，44(4)：199-206.

[21] ADAMS S，BRAIDY N，BESSEDE A，etal.The kynurenine pathway in brain tumor pathogenesis[J].CancerRes，2012，72(22)：5649-5657.