靶向沉默DEK对肝癌HepG2细胞增殖及细胞周期的影响

李伟伟，耿晓松，孙建伟，段树鹏，宋新文，申保生

(1.新乡医学院第一附属医院感染疾病科，河南 卫辉 453100；2.新乡医学院护理学院，河南 新乡 453003；3.新乡医学院第一附属医院科研科，河南 卫辉 453100)

DEK蛋白是一种普遍存在的可磷酸化的染色质架构蛋白[1]。目前，DEK被确认为是一种癌基因，DEK过度表达可能参与了细胞中致癌基因的突变，导致癌症的发生、发展[2]。关于DEK在肝癌细胞中的作用及功能，目前国内外文献报道尚少。因此，本研究应用RNA干扰技术下调人肝癌细胞株HepG2细胞中DEK表达，研究其表达下调对HepG2细胞增殖、细胞周期分布的影响，并探讨可能的分子机制，为治疗肝癌提供新的检测、诊断和治疗方法。

1 材料与方法

1.1材料人肝癌细胞株HepG2购自中国科学院上海细胞库，RPMI-1640培养液、胰蛋白酶、胎牛血清、LipofectamineTM2000脂质体转染试剂盒购自美国Invitrogen公司，DEK引物由南京凯基生物公司合成，抗体DEK、细胞周期素D1(Cyclin D1)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗均购自美国Santa Cruz公司，Annexin V-异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)凋亡检测试剂盒购自美国Biovision公司。实时定量聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction，RT-PCR)仪购自新加坡Life Technologices公司，流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养及分组HepG2细胞为贴壁细胞，置于含体积分数10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 mg·L-1链霉素的RPMI-1640培养基中培养，每2～3 d传代1次。待细胞生长至90%融合度时分为空白对照组、小分子干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)对照组和DEK siRNA组。空白对照组细胞正常培养，不做任何处理；siRNA对照组和DEK siRNA组细胞分别在LipofectamineTM2000脂质体介导下进行siRNA表达载体和DEK siRNA表达载体转染。

1.2.2RT-PCR检测HepG2细胞中DEKmRNA表达收集各组HepG2细胞，按照TRIzol RNA试剂盒说明书步骤操作，反转录成cDNA，然后以cDNA为模板，以荧光定量PCR的方法扩增DEK mRNA，RT-PCR检测各组细胞中DEK mRNA的表达。DEK引物序列：上游为5′-AACGTGGGTCAGTTC-AGTGGC-3′，下游为5′-TTCGCTGTTCACGCCTGACCT-3′。GAPDH引物序列：上游为5′-GCGTCG-TCGACAACGGCTC-3′，下游为5′-CAAACATGATCTGGGTCATCTTTC-3′。PCR 反应条件：95 ℃ 1 min、95 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，共30个循环。实验重复3次，计算Ct值，采用2-△△Ct法进行计算分析。

1.2.3免疫蛋白印迹法(Westernblot)检测HepG2细胞中DEK和CyclinD1蛋白表达收集转染48 h后的各组HepG2细胞，按说明书提取总蛋白，二辛可酸(bicinchoninic acid，BCA)法测蛋白浓度。凝胶电泳后转印至聚偏二氟乙烯膜上，用含质量分数5%的脱脂牛奶于常温下封闭l h，分别加入稀释过的磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)、DEK、CyclinD1一抗，于4 ℃下孵育过夜。次日洗膜后，加入对应的第二抗体孵育90 min，增强型化学发光试剂显影、定影。采用Quantity One软件分析蛋白表达灰度值，蛋白相对表达水平为目的基因灰度值与内参基因灰度值的比值，以GAPDH为内参。

1.2.4四甲基偶氮唑盐(methylthiazolyltetrazolium，MTT)法检测HepG2细胞增殖取对数生长期HepG2细胞，按每孔5×104个细胞接种于96孔板，继续培养并进行转染，每组设4个复孔，同时设空白对照，分别于转染后24、48、72、96、120 h加入 5 g·L-1的MTT溶液 20 mL，继续培养3 h，弃去上清液，每孔加入二甲基亚砜150 μL，震荡使结晶溶解混匀后，以空白孔为对照，酶标仪490 nm波长读取各孔吸光度值，吸光度值越高，代表细胞增殖能力越强。

1.2.5流式细胞仪检测细胞周期收集转染48 h后的各组HepG2细胞，800 r·min-1离心10 min，4 ℃ 下体积分数70%乙醇固定细胞过夜，磷酸盐缓冲液洗涤3次，加入1 g·L-1核糖核酸酶(ribonuclease，RNase)200 μL，37 ℃温育30 min，加入PI染液1 mL，4 ℃避光放置30 min后进行流式细胞仪检测。

2 结果

2.13组HepG2细胞中DEKmRNA及DEK、CyclinD1蛋白表达比较结果见图1和表1。空白对照组、siRNA对照组和DEK siRNA组HepG2细胞中DEK mRNA及DEK、CyclinD1蛋白表达总体比较差异有统计学意义(P<0.05)；DEK siRNA组HepG2细胞中DEK mRNA及DEK、CyclinD1蛋白表达低于空白对照组和siRNA对照组，差异均有统计学意义

(P<0.05)；空白对照组和siRNA对照组HepG2细胞中DEK mRNA及DEK、CyclinD1蛋白表达比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

1：空白对照组；2：siRNA对照组；3：DEK siRNA组。

图1转染48h后3组HepG2细胞中DEK和CyclinD1蛋白表达

Fig.1ExpressionofDEKandCyclinD1proteininHepG2cellsafter48htransfectioninthethreegroups

表13组HepG2细胞中DEKmRNA及DEK、CyclinD1蛋白表达比较

注：与空白对照组和siRNA对照组比较aP<0.05。

2.23组HepG2细胞增殖能力比较结果见表2。DEK siRNA组转染后24、48、72、96、120 h的细胞增殖能力均低于空白对照组和siRNA对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；空白对照组和siRNA对照组各时间点细胞增殖能力比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

表23组HepG2细胞增殖能力比较

注：与空白对照组和siRNA对照组比较aP<0.05。

2.33组HepG2细胞的细胞周期比较结果见表3。DEK siRNA组G0+G1期细胞所占比例高于空白对照组和siRNA对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；DEK siRNA组S期、G2+M期细胞所占比例均低于空白对照组和siRNA对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；空白对照组和siRNA对照组G0+G1期、S期、G2+M期细胞所占比例比较差异均无统计学意义(P>0.05)。

2.4CyclinD1蛋白表达与DEKmRNA和DEK蛋白表达的相关性Pearson相关性分析结果显示，CyclinD1蛋白表达与DEK mRNA和DEK蛋白表达均呈正相关(r=0.909、0.899，P<0.05)。

表33组HepG2细胞的细胞周期分布比较

注：与空白对照组和siRNA对照组比较aP<0.05。

3 讨论

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界第5大常见肿瘤，进展迅速，预后较差，在癌症相关病死率中排名第3[3-4]。DEK作为一种新的DNA 拓扑结构调节蛋白，位于染色体6p22.3，由375个氨基酸残基组成。人类的DEK蛋白最初发现于一种急性髓细胞系白血病，且DEK可作为自身抗原出现在系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等自身免疫性疾病[5-6]。DEK蛋白与恶性肿瘤的发生、发展关系密切，可通过多种途径调控细胞的增殖、分化、凋亡、迁移等过程。YU等[7]研究发现，DEK在肝癌细胞系(SMMC7721、HepG2、Hep3B、MHCC97L、MHCC97H)中的表达显著高于正常肝细胞HL7702；林黎娟等[8]研究发现，HCC组织中DEK蛋白阳性表达显著高于癌旁肝组织，且HCC组织中DEK蛋白阳性表达与组织分化程度及淋巴结转移密切相关；提示DEK蛋白与HCC进展密切相关。siRNA技术是目前肿瘤基因领域常用的研究手段。本研究应用DEK siRNA转染人肝癌细胞株HepG2，结果显示，HepG2细胞中DEK mRNA和蛋白表达均下调，说明siRNA可以特异性下调靶基因的表达，进而影响细胞的生物学特性，具有高效性、特异性。

细胞癌变与增殖失控具有明确的关系，细胞周期主要分为G1、S、G2和M期，遵循G1→S→G2→M的发展规律，是细胞生命活动的基本过程，细胞一旦从G1期进入S期则可自动完成分裂过程[9]。Cyclin D1是G1期进展的限速控制因素，能够抑制细胞进入S期进行DNA复制和分裂[10]。研究表明，DEK主要在增殖活跃的细胞和癌细胞中高表达，外周血来源的正常淋巴细胞被有丝分裂原刺激增生后，DEK表达显著上调[11]；乳腺癌组织和细胞系中DEK均为高表达状态[5]；转移性黑素瘤中DEK表达高于良性痣[12]；张彩凤等[13]应用特异性siRNA沉默胃癌SGC-7901细胞DEK表达后，通过细胞计数试剂盒检测，发现SGC-7901细胞增殖能力降低；刘岿然等[14]将表达DEK siRNA的重组质粒psiRNA-hHDEK转染宫颈癌CaSki细胞后，发现细胞增殖抑制率显著升高。本研究结果显示，特异性DEK siRNA下调HepG2细胞中DEK表达后，HepG2细胞增殖能力降低，G0+G1期细胞比率升高，S期及G2+M期细胞比率降低，与上述研究结果一致。相关性分析显示，DEK基因表达下调后，Cyclin D1基因表达出现同步下调，提示DEK siRNA可能通过抑制Cyclin D1蛋白表达而抑制肿瘤细胞的生长，但其具体机制及是否存在相关信号通路有待进一步深入研究。

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