蒲黄炒阿胶的质量标准研究

周 坚，张华锋，王亚琼，陈 荣，鲁 辉

(苏州市药品检验检测研究中心，苏州 215104)

阿胶珠为马科动物驴EquusasinusL.的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体胶(阿胶)的炮制品[1]。在古代有猪脂浸炙、炒制、熬制、蛤粉炒制和蒸制等法，现代炮制有生制、蛤粉炒制和蒲黄炒制等法。古代阿胶所采用的各类炮制方法，具有矫臭矫味、使其质地酥脆而便于粉碎和降低其腻滞性的作用[2-8]。蒲黄生用性凉，行血而兼消，炒后味涩，调血补血且止血，蒲黄炒阿胶会增强其补血止血作用[9-14]。江浙地区盛产蒲黄，蒲黄炒阿胶自古盛行，但缺乏相应标准对蒲黄炒阿胶的质量进行控制，阿胶经蒲黄炒制后产生哪些变化也没有相关资料参考，本实验以《中国药典》2015年版阿胶[15]项下的检验项目为参考，考察阿胶经蒲黄炒制后的变化。

1 仪器与试药

1.1仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪，配VWD检测器，ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)(安捷伦科技有限公司)；UPLC-Xevo TQ-S质谱仪，配Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)(沃特世科技有限公司)；Xseries 2 ICP-MS，Sorvall ST 8 台式离心机(赛默飞世尔科技公司)；AG245电子天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)；BX43显微镜(奥林巴斯有限公司)。

1.2试药 异硫氰酸苯酯(PITC)、三乙胺、甲酸和乙腈(Sigma-Aldrich公司)；碳酸氢铵、醋酸钠、醋酸、盐酸、水合氯醛和氢氧化钠均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；胰蛋白酶(批号140615-200206，中国食品药品检定研究院)；超纯水(Millpore公司)。

所用对照品均来自中国食品药品检定研究院，L-羟脯氨酸(批号111578-201602)，甘氨酸(批号140689-201605)，丙氨酸(批号140680-201604)，L-脯氨酸(批号140677-201507)，阿胶(批号121274-201202)。蒲黄炒阿胶的样品自行炮制3批，样品信息见表1。

表1样品信息

Tab.1 Sample information

蒲黄炒阿胶编号阿胶编号厂家批号QS0248SZ2016QS0248山东阳谷古阿井阿胶厂2015122401QS0801SZ2016QS0801河南省四方药业集团有限公司160309QS0825SZ2016QS0825山东济水阿胶有限公司20160123

2 结果

2.1炮制与性状 自行炮制3批，炮制过程中，蒲黄易生火、起烟，温度较难控制。建议先将阿胶块放入40 ℃烘箱中加热软化，切制成小方块状，再热锅把蒲黄迅速炒制至黄褐色后，将阿胶块放入翻炒，鼓起后迅速捞出，关火降温。阿胶珠样品呈圆球状，表面呈深土黄色，质脆泡酥，中空，略呈海绵状，不黏连，无枯焦。

2.2显微鉴别 粉末呈褐色。可见蒲黄花粉粒，花粉粒类圆形或椭圆形，直径18～25 μm，表面有网状雕纹，周边轮廓线光滑，呈凸波状或齿轮状，具单孔，不甚明显。阿胶部分为大量圆形油滴，可见孔洞样透明块状物。

2.3质谱鉴别 随着科技的发展和质谱的普及，越来越多的中药材开始采用质谱法进行质量控制和研究[16-19]。本项目按照《中国药典》2015年版阿胶项下测定，取蒲黄炒阿胶粉末0.1 g，加入质量浓度为10 g·L-1的碳酸氢铵溶液50 mL，超声处理30 min，用微孔滤膜滤过，取续滤液100 μL，置于微量进样瓶中，加胰蛋白酶溶液10 μL(取序列分析用胰蛋白酶，加入质量浓度为10 g·L-1的碳酸氢铵溶液配制成质量浓度为1 mg·mL-1的胰蛋白酶溶液，临用时配制)，摇匀，37 ℃恒温酶解12 h，作为供试品溶液。另取阿胶对照药材0.1 g，同法制成对照药材溶液。采用质谱检测器，电喷雾正离子模式(ESI+)，进行多反应监测(MRM)，选择质荷比(m/z)539.8 (双电荷)→ 612.4和m/z539.8(双电荷)→ 923.8作为检测离子对。吸取供试品溶液5 μL，注入高效液相色谱-质谱联用仪，测定。3批样品均呈现与对照药材色谱保留时间一致的色谱峰，见图1。

2.4水分 按照《中国药典》2015年版阿胶项下规定水分不得过15.0%，本实验3批样品测定结果分别为5.2%，5.5%和5.7%，蒲黄炒制导致水分含量降低，建议以均值120%为限，规定水分不得过6.5%。

2.5重金属及有害元素 《中国药典》2015年版阿胶项下规定，铅、镉、砷、汞和铜分别不得超过5，0.3，2，0.2和20 mg·kg-1。3批样品中重金属及有害元素测定结果见表2，建议蒲黄炒阿胶的重金属及有害元素限量同《中国药典》2015年版阿胶项下规定。

表2蒲黄炒阿胶中铅、镉、砷、汞及铜的含量

Tab.2 The contents of Cu，As，Cd，Hg and Pb in donkey-hide gelatine fied by cattail pollen (mg·kg-1)

图1样品MRM图谱

A.m/z539.8→ 612.4离子对；B.m/z539.8→ 923.8离子对；1.离子对峰。

Fig.1 MRM chromatography of the sample

A.m/z539.8→ 612.4 ion pair；B.m/z539.8→ 923.8 ion pair；1.ion peak.

2.6水不溶物 《中国药典》2015年版阿胶项下规定水不溶物含量不得过2.0%。本实验3批样品测定结果分别为4.7%，2.2%及1.1%。鉴于蒲黄的附着，可能导致水不溶物增加，因此建议删除此项。

2.7氨基酸含量测定

2.7.1标准曲线及线性考察 将混合对照品溶液稀释为5个质量浓度，分别进样10 μL，以对照品质量浓度为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y)，分别绘制标准曲线，并计算回归方程，得L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸及L-脯氨酸的回归方程分别为y=7 895x+25.36(r=0.999 9)，y=9 632x+15.74(r=0.999 9)，y=6 875x+58.34(r=0.999 9)和y=7 324x+42.35(r=0.999 9)，线性范围分别为0.034～0.510，0.015～0.225，0.028～0.421和0.023～0.345 mg·mL-1。结果表明，线性关系良好。

2.7.2精密度实验 精密吸取混合对照品溶液10 μL，连续进样6 次，按照峰面积计算L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸及L-脯氨酸的RSD值分别为0.18%，0.08%，0.15%和0.1%。结果表明，该方法精密度良好。

2.7.3稳定性实验 精密吸取同一供试品溶液10 μL，分别于2，4，8，12，16和24 h 注入液相色谱仪，结果显示，供试品溶液在24 h内基本稳定，6 次测定L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸及L-脯氨酸的RSD值分别为0.35%，0.21%，0.23%和0.24%。结果表明，样品在24 h内稳定。

2.7.4重复性实验 取同一批(批号QS0248)样品，制备6份样品溶液进样测定，得L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸及L-脯氨酸的RSD值分别为2.78%，1.48%，1.39%和1.54%。结果表明，该方法重复性良好。

2.7.5加样回收率实验 精密称取同一批(批号QS0248)样品5份，每份分别精密加入等质量的混合对照品溶液，同《中国药典》2015年版阿胶[15]项下样品制备方法制备后进样，以外标法计算平均回收率和RSD值。结果见表3。

表34种氨基酸含量测定的回收率结果

Tab.3 The results of recovery test of the quantitative analysis of 4 amino acids

成分平均含量/%加入量/%平均测得量/%平均回收率/%L-羟脯氨酸8.410.0018.095.9甘氨酸18.020.0037.798.5丙氨酸7.110.0016.796.3L-脯氨酸10.210.0020.097.6

2.7.6含量测定 按照《中国药典》2015年版阿胶项下干燥品的规定计算，含L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和L-脯氨酸分别不得少于8.0%，18.0%，7.0%和10.2%，3批样品测定结果见表4。阿胶经蒲黄炒制后样品色谱图与原阿胶样品色谱图无异且含量差别变化不大，见图2。因此，建议同《中国药典》2015年版阿胶项下规定。

图2HPLC图

A.混合对照品溶液；b.阿胶样品溶液；c.蒲黄炒阿胶样品溶液；1.L-羟脯氨酸；2.甘氨酸；3.丙氨酸；4.L-脯氨酸。

Fig.2 HPLC chromatograms

A.mixed reference solution；b.sample of donkey-hide gelatine；c.sample of donkey-hide gelatine fied by cattail pollen；1.L-hydroxyproline；2.glycine；3.alanine；4.L-proline.

表4蒲黄炒阿胶后4种氨基酸的含量变化

Tab.4 The changes of the contents of 4 amino acids in donkey-hide gelatine fied by cattail pollen

编号L-羟脯氨酸/%炒制后炒制前甘氨酸/%炒制后炒制前丙氨酸/%炒制后炒制前L-脯氨酸/%炒制后炒制前QS02488.48.818.018.77.07.610.210.8QS080110.29.921.221.78.18.912.012.4QS08258.89.219.220.77.58.010.911.5

3 讨论

近年来，由于冬季膏方的盛行，越来越多的阿胶被直接投入于膏方中熬制，很少再用炮制品，但自古阿胶的炮制具有增效降腻的作用，炮制作为一门古老的技艺也逐渐被快节奏、简易的用药方法取代，但中药的服用终归还需依照中医用药的老传统，才能够更好地发挥药效，为病体康健提供保障。

为了杜绝近年来在阿胶中添加猪皮、牛皮等弄虚作假行为，阿胶的法定药典标准已越来越全面，然而各种炮制品却没有得到同等的重视，蒲黄炒阿胶作为江浙地区盛行的炮制方法，阿胶珠也作为地方特色在市井的药房中存在，对蒲黄炒阿胶的质量进行控制，填补阿胶炮制品质量控制的空白，对地方特色品种进行保护和传承。

阿胶经蒲黄炒制后，性状发生了很大变化，由坚韧黏腻变得酥脆易碎，便于药用。显微鉴别中增加了蒲黄花粉粒的特征，虽然炒制后，仅阿胶珠表层黏附一层薄薄的蒲黄花粉粒，但对于用药而言，增加了一味能够止血、化瘀、通淋的中药。由于蒲黄花粉粒的附着，导致阿胶珠的水不溶物含量增加，实验中将蒲黄花粉粒洗去后，再次测定，基本无水不溶物，可见炒制更有利于增加阿胶的水溶性。同时，高温炒制并不影响质谱中特征离子和4种氨基酸成分的分析，且蒲黄炒制后样品色谱图与原阿胶样品色谱图基本一致，4种氨基酸的含量并无显著差别，由此可见，控制阿胶及阿胶珠的质量，仅通过氨基酸的分析还不够，应寻找具有药效价值的蛋白、多肽或其他类成分等进行质量控制。随着科技的进一步发展，还需要更多的成分分析参与来寻找炮制后的特征产物。本实验为蒲黄炒阿胶质量标准的制定提供了有力参考，同时也为进一步研究指明了方向。

[1] 江苏省药品监督管理局.江苏省中药饮片炮制规范[M].南京：江苏科学技术出版社，2002:454.

[2] 蒋晓煌，蒋孟良，贺卫和，等.不同炮制方法对阿胶珠品质影响的研究[J].中国现代中药，2013，15(1):53-55.

[3] 谢丽莎.阿胶的炮制研究近况[J].中国中医药信息杂志，2003，10(11):80-81.

[4] 潘登善.阿胶炮制研究[J].陕西中医，2003，24(5):462-464.

[5] 程一帆，苟虹，谭淇文.正交实验优选阿胶、龟甲胶、鹿角胶的微波炮制胶珠工艺的研究[J].中草药，2010，41(1):45-48.

[6] 黄泰康.阿胶炮制史及其研究[J].南京中医学院学报，1988，(4):53，35.

[7] 崔金玉，贾天柱.微波炮制阿胶珠的工艺研究[J].中成药，2008，30(5):709-711.

[8] 邓水蓉，袁勇，吴细妹，等.阿胶炮制工艺探讨[J].江西中医学院学报，1995，(S1):27-29.

[9] 贺卫和，蒋孟良，曾婷，等.胶艾汤中阿胶炮制对其止血作用影响的研究[J].中华中医药学刊，2011，29(10):2315-2316.

[10]张保国.阿胶的现代炮制研究[J].河南大学学报：医学科学版，2003，22(2):1-4.

[11]蒋晓煌，蒋孟良，贺卫和，等.不同炮制方法对阿胶珠品质影响的研究[J].中国现代中药，2013，15(1):53-55.

[12]崔金玉，贾天柱.阿胶及不同炮制品的药理作用研究[J].中成药，2008，30(12):1841-1842.

[13]刘谷全.中药阿胶的临床应用及药理作用[J].临床合理用药，2014，7(12B):74-75.

[14]郭中坤，王可洲，籍国霞，等.阿胶的成分、鉴别方法及药理作用研究进展[J].辽宁中医药大学学报，2015，17(4):71-74.

[15]国家药典委员会.中国药典：2015年版：一部[S].北京:中国医药科技出版社，2015:189.

[16]哈及尼沙，古丽巴哈尔·卡吾力，阿米乃木·买买提，等.HS-SPME/GC-MS法分析榅桲果实中的挥发性成分[J].西北药学杂志，2017，32(3):263-266.

[17]许淑珍，冯芳.中药材伪品研究方法与技术[J].广州化工，2017，45(8):25-27.

[18]张朝辉，谷陟欣，刘婧靖，等.直喷离子化质谱简单快速鉴别关木通[J].分析化学研究报告，2017，45(8):1143-1148.

[19]张海江，蔡小军，程翼宇.高效液相色谱-电喷雾质谱法鉴别人参、西洋参和三七的皂苷提取物[J].中国药学杂志，2006，41(5):391-394.