C反应蛋白对大鼠心肌细胞缺血再灌注损伤的影响及其机制

裴玮娜，呼海娟，刘凡，鲁静朝，杨秀春，崔炜

(河北医科大学第二医院·河北省心脑血管病研究所，石家庄050000)

C反应蛋白(CRP)是一种由肝脏合成的急性时相蛋白，是预测未来心血管事件的独立危险因素[1, 2]，而且病理水平的CRP可能直接参与了动脉粥样硬化的形成、演变以及缺血再灌注损伤的过程[3]。然而，CRP是否能够直接加重心肌缺血再灌注损伤这一过程及其发生机制目前尚不十分明确。2015年3月～2016年3月，我们采用乳鼠原代培养的心肌细胞建立氧糖剥夺再灌注模型，探讨CRP作为刺激因子对心肌缺血再灌注损伤的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料 人重组CRP 购自于Calbiochem公司，Ⅱ型胶原酶购自于美国Gibco公司，二氮嗪(DZ)和环孢素A (CsA)均购自于Sigma公司，乳酸脱氢酶(LDH)漏出检测试剂盒由中国南京市建城生物工程研究所提供。鲎试剂内毒素去除试剂盒购自厦门鲎试剂生物科技股份有限公司。CRP制剂去除内毒素，经纯化后由鲎试剂测定CRP中内毒素浓度<0.1 EU/mL。

1.2 细胞培养 取出生1～2 d的新生SD大鼠心室心肌细胞,应用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶消化，然后用包含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/mL链霉素的高糖DMEM培养基进行培养。心肌细胞以1×105/mL的密度接种于96孔板上，置于37 ℃、5%的CO2培养箱中培养72 h，其中培养48 h后更换细胞培养液。在培养基中加入5-溴-2'-脱氧尿苷以抑制成纤维细胞的附着和增殖。利用抗α-肌动蛋白免疫组化法鉴定心肌细胞，培养细胞中95%以上为心肌细胞。

1.3 氧糖剥夺再灌注模型 (OGD/R)建立 原代培养的心肌细胞经过不同处理方案后进行氧糖剥夺3 h，再灌注1 h。将加入了无糖DMEM培养液心肌细胞置于三气培养箱内(5%CO2和95% N2，37℃)培养3 h。再灌注时，则将无糖DMEM培养基更换为高糖DMEM培养基，并置于5%CO2培养箱中(21%O2和5%CO2)37℃孵育1 h，以此来模拟体内的缺血再灌注过程。

1.4 细胞分组 原代培养的新生SD大鼠心肌细胞随机分为以下5组。①对照组：没有经过OGD/R的正常培养组。②OGD/R组：培养后建立OGD/R；③CRP+OGD/R组：进行OGD/R之前，应用10 μg/mL的CRP与心肌细胞共同孵育24 h；④CRP+CsA+OGD/R组：心肌细胞先与CRP共同孵育24 h，然后进行3 h的氧糖剥夺。在再灌注开始时加入10 μmol的CsA与心肌细胞孵育20 min；⑤CRP+DZ+OGD/R组：心肌细胞先与CRP共同孵育24 h，在进行OGD/R前，加入100 μmol的二氮嗪共同孵育90 min，再进行OGD/R。

1.5 心肌细胞活力测定 采用MTS法测定心肌细胞活力。各组样品37 ℃避光培养1 h，使用酶标仪在490 nm处检测各孔吸光度(OD)值，以OD值间接反映心肌细胞活力。

1.6 心肌细胞培养液LDH水平检测 实验结束时留取各组心肌细胞培养液，以1 000 r/min 离心1 min后取上清液，标本置于-80 ℃低温冰箱保存、备用。通过检测从质膜破裂细胞中释放到培养液中的LDH水平，判断细胞坏死程度。

1.7 线粒体膜通透性转换孔(mPTP)开放水平测定 采用calcein/AM免疫荧光法。选择复氧后20 min测定心肌细胞的绿色荧光强度，设定激发光为488 nm，检测光为505nm，通过Image J软件分析绿色荧光强度，以此确定mPTP开放水平。绿色荧光强度的变化与mPTP开放程度呈反比。

1.8 线粒体膜电位水平测定 采用四甲基罗丹明乙酯(TMRE)免疫荧光法。设定激发光为543 nm，检测光为580 nm，通过Image J软件分析红色荧光强度，以此确定线粒体膜电位水平。红色荧光强度与线粒体膜电位水平呈正比。

2 结果

2.1 各组心肌细胞活力比较 以对照组心肌细胞活力为100%，其他各组心肌细胞活力以占对照组数值的百分比表示。OGD/R组、CRP+OGD/R组、CRP+CsA+OGD/R组、CRP+DZ+OGD/R组心肌细胞活力分别为82.36%±6.18%、64.84%±4.06%、91.30%±5.18%、92.63%±5.74%。经过OGD/R处理后，心肌细胞活力下降；CRP预处理组可进一步降低心肌细胞活力；给予CsA或DZ预处理后心肌细胞活力增高；差异均有统计学意义(P均<0.05) 。

2.2 各组心肌细胞培养液LDH水平比较 对照组、OGD/R组、CRP+OGD/R组、CRP+CsA+OGD/R组、CRP+DZ+OGD/R组心肌细胞培养液LDH水平分别为(95.10±21.57)、(145.30±16.06)、(208.20±19.23)、(92.72±17.56)、(93.37±23.99)U/L。与对照组比较，OGD/R组心肌细胞培养液LDH水平上升；给予CRP预处理后，LDH水平进一步升高；预先给予CsA或DZ处理均能够降低LDH水平；差异均有统计学意义(P均<0.05)。

2.3 各组mPTP开放水平比较 以对照组mPTP绿色荧光强度为100%，各组与对照组比较进行标准化处理。OGD/R组、CRP+OGD/R组、CRP+CsA+OGD/R组、CRP+DZ+OGD/R组mPTP绿色荧光强度分别为60.93%±2.82%、33.08%±3.48%、85.09%±4.11%、81.17%±4.13%。与对照组相比，OGD/R组心肌细胞mPTP开放水平升高；给予CRP干预mPTP开放水平进一步升高；预先给予CsA或DZ处理mPTP开放水平降低；差异均有统计学意义(P均<0.05)。

2.4 各组线粒体膜电位水平比较 以对照组粒体膜电位红色荧光强度为100%，各组与对照组比较进行标准化处理。OGD/R组、CRP+OGD/R组、CRP+CsA+OGD/R组、CRP+DZ+OGD/R组线粒体膜电位红色荧光强度分别为57.26%±2.95%、33.31%±2.03%、77.35%±2.38%、72.26%±2.45%。与对照组比较，OGD/R组线粒体膜电位水平降低；给予CRP干预膜电位水平进一步下降；预先给予CsA或DZ处理膜电位水平升高；差异均有统计学意义(P均<0.05)。

3 讨论

目前，再灌注治疗已经成为缺血性心脏病的重要治疗手段。然而再灌注的同时会导致细胞损伤及心脏功能障碍，即形成心肌缺血再灌注损伤(MIRI)[4]。建立心肌细胞缺血再灌注损伤模型，对于在细胞层面研究这一病生理过程意义重大。为此，本研究通过原代培养SD大鼠心肌细胞并建立OGD/R模型来模拟体内的心肌缺血再灌注损伤的病理过程。

CRP不仅仅是急性期时相的一种炎症标记物，而且与动脉粥样硬化的发生和发展有密切关系，CRP可以预测冠心病患者日后发生心血管事件的风险[5～8]。Paul等[9]研究证实，人类CRP转基因表达加速了缺乏载脂蛋白E的小鼠主动脉粥样硬化的进程。Verma等[10]研究表明，CRP可以促进内皮细胞的活化、加重功能障碍，诱导了细胞凋亡蛋白酶介导的人类冠状动脉血管平滑肌细胞的凋亡，从而加重了心肌梗死和动脉粥样硬化血栓的形成。此外，他们还发现这些影响与CRP中的叠氮化钠或内毒素无关。研究认为，CRP的作用机制包括补体的激活、血管壁损伤、血栓形成状态、内皮功能障碍以及氧化低密度脂蛋白的调节作用等[11]。另有报道显示，CRP检测对原发性心血管疾病预防及心力衰竭、房颤和冠状动脉支架血栓形成或再狭窄的预后判断有重要作用。此外，已有一些研究探讨了CRP对心肌缺血再灌注损伤的影响[12]。

Thiele等[13]认为CRP五聚体的分离，即由五聚体结构分离成单体结构这一过程可以调节急性炎症反应(心脏缺血/再灌注)和慢性炎症过程(动脉粥样硬化)。一些关于肠道、肾脏、肝脏等器官的缺血再灌注动物模型的实验研究显示加入CRP干预后可以增加组织损伤[14,15]。本研究显示，在OGD/R前给予CRP干预24 h能够明显降低心肌细胞活力，并升高LDH浓度水平。提示CRP直接加重了OGD/R损伤，此为临床减少再灌注损伤提供了新的治疗靶点。

心肌缺血再灌注损伤与线粒体ATP敏感性钾通道(mitoKATP)的抑制和mPTP通道的开放息息相关。越来越多的证据表明，作为一种位于线粒体内膜中的非选择性高电导通道，mPTP的开放介导了缺血再灌注损伤早期的细胞凋亡。在缺血发生时，mPTP处于关闭状态。再灌注开始后，线粒体Ca2+浓度明显增高，并且活性氧簇(ROS)生成增加，引起mPTP开放，继而产生一系列的病理过程，导致心肌细胞死亡。研究发现，mitoKATP在缺血预处理心肌保护中有重要作用。在缺血过程中，mitoKATP通道的开放会导致线粒体膜的去极化，线粒体膜电位的降低，从而导致蛋白激酶C活化，抑制ROS的生成，进而抑制细胞的凋亡。DZ是一种选择性的mitoKATP通道开放剂，它通过保护线粒体完整性和抑制细胞凋亡来减少线粒体损伤。CsA是一种mPTP的抑制剂，已经被证实其可以减少心肌梗死面积，维持心脏功能。本研究发现，与对照组相比，OGD/R组心肌细胞mPTP开放升高、线粒体膜电位水平降低；给予CRP干预mPTP开放水平进一步升高、膜电位水平进一步下降；预先给予CsA或DZ处理mPTP开放降低、膜电位水平升高。同时，各组心肌细胞活力和LDH水平随mPTP开放水平、线粒体膜电位水平改变发生相应变化，此可能就是CRP加重心肌缺血再灌注损伤的机制。

综上所述，CRP能够直接加重心肌缺血再灌注损伤。CRP促进mPTP开放并降低线粒体膜电位可能是其加重心肌缺血再灌注损伤的机制之一。