大鼠血管平滑肌细胞IκB激酶2对血管舒缩调控的作用及机制

李袁静，高凌云，杨昌军，蔡明

(1重庆医科大学附属第一医院，重庆400006；2美国俄亥俄州立大学心肺研究中心)

血管平滑肌细胞是一类具有高度特异性的细胞,主要功能是通过收缩和舒张作用调节血管腔大小，进而影响血流量及血压，其舒缩调控机制与细胞肌球蛋白轻链(MLC) 第19号丝氨酸的磷酸化水平相关。已经证实，肌球蛋白轻链激酶(MLCK)磷酸化作用对机体血压的调节有重要影响[1]。但除MLCK外，越来越多的研究表明还存在对细胞MLC有磷酸化作用的其他激酶存在。当平滑肌细胞缺乏促收缩因素或使用MLCK抑制剂，细胞内仍有较低水平的MLC磷酸化。IκB激酶2(IKK2)是NF-κB活化的重要激酶[2,3]，可磷酸化多种底物并参与细胞增殖、迁移、胰岛素敏感性改变等多种细胞反应[4,5]。最近研究发现，IKK2抑制剂包括化学物或抑制肽均有血管舒张作用，IKK2对血压改变可能有重要影响。为寻找高血压防治新靶点，2014年12月～2016年3月，我们就IKK2对血管舒缩的调控作用进行了研究。

1 材料与方法

1.1 主要材料 16周龄SD大鼠(重庆医科大学动物中心提供，实验获重庆医科大学附属第一医院实验动物伦理委员会审核)，MLC小鼠抗体(Ser19，Cell Signaling Technology)，抗MLC小鼠抗体(Sigma)，兔抗IkBa(Cell Signaling Technology)，actin单克隆抗体(Sigma)，flag小鼠抗体(Sigma)，兔抗IKK2(Sigma)，兔抗IKK1(Sigma)，兔抗Zip激酶(Abcam),兔抗ILK(Abcam)，小鼠抗NEMO(Cayman Chemicals)，小鼠抗磷酸化IkBa(Ser32/36，Cell Signaling Technology)，小鼠抗RhoA(BD Transduction Laboratories)和兔抗IKKα/β(Ser176/Ser180，Cell Signaling Technology)，HTScan激酶测量试剂盒(Cell signaling technology)。

1.2 去内皮胸主动脉环制备 将SD大鼠用戊巴比妥盐水麻醉，迅速切取胸主动脉并用 PSS洗净。将主动脉切成2 mm宽环状，并通过机械摩擦的方式移除血管内皮。血管环用两根不锈钢微型挂钩贯穿血管管腔，水平悬挂于10 mL浴漕内，下方固定，上方以一细钢丝连于张力换能器，经Multi Myograph System计算机生物信号采集分析系统记录血管的张力变化。每个血管环悬挂于浴管(浴管内含有95% O2和5% CO2、37 ℃的PSS液10 mL)后，基础张力调至30 mN，平衡1 h。动脉环用80 mmol/L KCl液多次刺激。当达到坪值后，加入乙酰胆碱(10 μmol/L)。舒张幅度不超过收缩幅度的5%时，认为胸主动脉内皮去除完全。

1.3 IKK2抑制剂对胸主动脉环舒张效应检测 观察除血管内皮的大鼠主动脉环由血管收缩剂(去氧肾上腺素、KCl、U-46619、离子霉素、花萼海绵体诱癌素A)预处理，然后分别加入10 μmol/L IMD0354、30 μmol/L SC-514。设置IKK2抑制多肽对照组。采用Multi Myograph System计算机生物信号采集分析系统记录血管张力变化。

1.4 MLCK抑制剂对IKK2磷酸化影响检测 将MCL与1 mmol/L的EGTA(为MLCK抑制剂)或对照组中分别加入25 nmol/L的IKK2、25 nmol/L的MLCK共孵育1 h，通过Western blotting检测MLC第19号丝氨酸的磷酸化水平。

1.5 IKK2抑制剂SC-514的舒血管效应可逆性检测 根据上述实验制备的动脉血管环预先使用去氧肾上腺素1 μmL处理，然后用SC-514舒张血管。设置IKK2抑制剂SC-514组和空白对照组。充分冲洗后，经Multi Myograph System计算机生物信号采集分析系统记录血管张力变化。

2 结果

2.1 IKK2抑制剂对胸主动脉环的舒张效应 IMD-035为IKK2选择性抑制剂，其对KCl、去氧肾上腺素、U-46619、离子霉素、花萼海绵体诱癌素A缩血管预处理的动脉作用10 min后，血管张力分别为55.3%±1.2%、47.0%±3.5%、61.2%±4.4%、37.5%±1.9%、41.0%±2.7%，与对照组(7.4%±0.9%)比较均有统计学差异(P均<0.05)。SC-514是IKK2的竞争性抑制剂，对去氧肾上腺素和KCL预处理的动脉同样有舒血管效应，血管张力分别为48.7%±3.9 %、32.1%±2.8% ，与对照组(9.4%±1.1%)比较均有统计学差异(P均<0.05)。

2.2 MLCK抑制剂对IKK2磷酸化的影响 对照组、MLCK组、IKK2组、EGTA组、MLCK联合EGTA组、IKK2联合EGTA组MLC磷酸化水平分别为1.04±0.03、1.96±0.03、1.72±0.07、0.61±0.03、1.06±0.04、1.70±0.03。MLC在MLCK 、IKK2作用下磷酸化程度增加，EGTA可降低MLCK对MLC的磷酸化水平，IKK2对对MLC的磷酸化活性不被EGTA所抑制。组间比较差异有统计学意义(P均<0.05)。

2.3 SC-514舒血管效应的可逆性 SC-514组SC-514浓度较低时(5 μmol/L)血管张力为77.5%±2.2%，对照组为76.1%±3.1%，两组比较无统计学差异(P>0.05)。增加SC-514浓度至15 μmol/L时血管张力为49.0%±2.7%，对照组为63.5%±1.8%，两组比较有统计学差异(P<0.05)。25 min后对两组大鼠主动脉环进行充分冲洗后再以去氧肾上腺素1 μmL处理，SC-514组、对照组血管张力分别为72.6%±3.2% 、74.1%±1.1%，两组比较无统计学差异(P>0.05)。表明SC-514对血管的舒张效应是可逆的。

3 讨论

目前已证实，除MLCK外还有多种激酶对MLC 第19号丝氨酸具有磷酸化作用，如Rho激酶、ILK、PAK和ZIPK。但关于这些激酶对血管平滑肌细胞MLC磷酸化作用尚存在争议。体外实验发现，使用Rho激酶抑制剂Y-27632对由花萼海绵体诱癌素A诱导的血管收缩和MLC的磷酸化并无拮抗作用，说明Rho激酶在血管平滑肌细胞中不是必需的MLC磷酸化激酶[6～9]。AV25和SM1是ZIPK的强效抑制剂，但它们并不能拮抗由肌球蛋白轻链磷酸化酶(MLCP)抑制引起的血管平滑肌收缩，从而排除ZIPK是血管平滑肌细胞中一类重要的MLC磷酸化激酶[10]。在哺乳动物中PAK分为6种，对其中研究最深入的是PAK1，并已证实其在神经细胞、乳腺癌细胞、HeLa细胞和肺内皮细胞中对MLC具有磷酸化作用。但沉默PAK1可诱导肌上皮细胞收缩，而不是舒张效应[11]。对豚鼠血管平滑肌细胞的研究发现，PAK1通过磷酸化可诱导血管舒张，进而抑制MLCK活性[12]，这说明PAK1可能不是血管平滑肌细胞中重要的MLC磷酸化激酶。在食管平滑肌细胞中，通过使用Okadaic酸抑制MLCP活性时可显著增强ILK活性；相反，当使用ILK抗体时可抑制由Okadaic酸所产生的细胞收缩，这些现象说明ILK在细胞内具有MLC磷酸化激酶活性[11]。

研究显示，IKK2是一类重要的磷酸化激酶[13]。为此，我们采用体外主动脉环实验进一步检测了IKK2对MLC的磷酸化激酶活性。我们体外实验初步通过IKK2抑制剂预处理小鼠，观察对肌肉微血管的舒张作用，结果证明IKK2是MLC一类重要的缩血管激酶。其中IKK2抑制剂IMD-0354对胸主动脉环的舒张效应研究发现，IMD-0354可显著减轻由各种缩血管因素引起的主动脉环的收缩，包括去氧肾上腺素、KCl、U-46619、离子霉素、花萼海绵体诱癌素A。IKK2抑制剂SC-514可通过对血管平滑肌细胞的凋亡作用产生舒血管效应，且其对血管的舒张作用可完全被逆转，从而排除SC-514对血管的舒张效应是通过降低血管平滑肌细胞活性所致。此外，已有文献报道IKK2抑制剂可诱导多种细胞凋亡的发生[14]。

综上所述，除MLCK外还有多种激酶对MLC第19号丝氨酸具有磷酸化作用，这些激酶主要有Rho激酶、ILK、PAK和ZIPK。但关于这些激酶对血管平滑肌细胞MLC磷酸化作用尚存在争议，且支持这些激酶在血管平滑肌细胞中有类似作用的证据极少。本研究证实IKK2亦具有MLCK缩血管作用的磷酸激酶活性，其抑制剂有舒血管作用。