抵抗素样分子影响大鼠主动脉壁血管平滑肌细胞收缩作用的机制

段淑香,张洪强,杨永曜,张红明,徐庆国

(1山东省立第三医院，济南250000；2济南军区总医院；3贵州省人民医院)

冠状动脉痉挛(CAS)是指心外膜下传导动脉发生一过性收缩，引起血管部分或完全闭塞，导致心肌缺血的一组临床综合征。CAS是构成多种心脏缺血性疾病的基本病因，包括变异型心绞痛、不稳定型心绞痛、猝死等[1]。目前CAS的确切发生机制不明确，推测可能与血管内皮功能障碍、氧化应激、血管平滑肌细胞高反应性以及血管收缩和舒张物质的失衡有关[2]。抵抗素样分子(RELMɑ)是脂肪组织分泌具有生物活性的蛋白质，有促进血收缩管、血管新生的作用。前期研究中，我们已证实RELMɑ在动脉粥样硬化斑块中强烈表达[3]，同时发现其也是血管生成的开关基因[4]。2016年8月～2017年3月，我们就RELMα信号转导通路对动脉粥样硬化中血管收缩动态平衡的影响进行了研究，以寻找CAS防治的新靶点。

1 材料与方法

1.1 材料 SD大鼠由山东大学实验动物中心提供；大鼠主动脉平滑肌细胞(RASMC)购自Scien Cell公司；DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶均购自美国Gibco公司；重组RELMα蛋白购自美国Prospec公司；兔源单克隆抗大鼠钙调素(CaM)、肌球蛋白轻链激酶(MLCK)抗体购自美国Abcam公司；CaM抑制剂W-7、MLCK抑制剂ML-7均购自美国Sigma公司；HRP标记的羊抗兔二抗购自北京中杉金桥公司。

1.2 大鼠血管环张力测定 取SD大鼠10只用10%水合氯醛麻醉，处死后打开胸腔，游离胸主动脉，置于4 ℃含95%O2和5%CO2混合气体预饱和的K-H液中，小心剔除胸主动脉周围结缔组织，剪成3～4 mm的血管环(去内皮血管环)。选取反应良好的血管环，利用Powerlab四道生理仪记录其张力变化。血管环稳定后，用移液器吸取RELMα、AngⅡ、MLCK抑制剂或者等量的平衡液分别向浴槽中加入，稀释后的浴槽浓度即为实验的终浓度，观察其对血管的效应。

1.3 RASMC培养 RASMC置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，使用的培养基为含10%胎牛血清、100 g/L青霉素和100g/L链霉素的DMEM高糖培养基，待细胞长至70%～80%融合时进行药物干预。采用3～5代细胞进行以下实验。

1.4 RASMC分组及干预 RASMC在6孔板中培养24 h后随机分为5组。正常对照组RASMC在37 ℃培养箱中培养48 h；阳性对照组用终浓度为1×10-7mol/L的AngⅡ刺激细胞48 h；RELMα刺激组：终浓度为4×10-8mol/L的RELMα刺激细胞48 h；RELMα+CaM抑制剂组：RELMα+W-7刺激细胞48 h；RELMα+ MLCK抑制剂组：RELMα+ML-7刺激细胞48h。

1.5 RASMC内CaM和MLCK蛋白表达检测 采用Western blotting法。提取各组RASMC总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。取30 μg蛋白上样，SDS-PAGE凝胶分离蛋白后，转移至PVDF膜上。5%脱脂牛奶室温封闭1.5 h，加入一抗4 ℃孵育过夜：抗CaM一抗(稀释度1∶1 000)，抗MLCK一抗(稀释度1∶3 000)，抗β-actin(浓度1∶1 000)。次日将膜取出，TBST洗脱3次，孵育二抗(浓度为1∶10 000)置于室温1.5 h。根据ECL试剂盒说明书操作发光自显影，拍照并用随机软件分析条带光密度。β-actin作为内参照物，通过计算CaM/β-actin、MLCK/β-actin的光密度比值求得各组CaM、MLCK蛋白表达。

2 结果

2.1 不同处理方式大鼠胸主动脉血管环张力变化 血管环在加入RELMα后2 min左右血管张力开始升高，10 min左右达到平台期；加入MLCK抑制剂，再加入RELMα后血管环张力无明显升高。加入等量平衡液、AngⅡ、RELMα、RELMα+MLCK处理血管环后，血管张力分别为7.27%±2.23%、59.97%±5.56%、85.07%±3.06%、11.02%±2.41%。与加入等量平衡液、AngⅡ比较，加入RELMα后血管张力升高；再加入ML-7后血管张力下降，且低于AngⅡ，差异均有统计学意义(P均<0.05)。

2.2 各组RASMC内CaM蛋白表达 正常对照组、阳性对照组、RELMα刺激组、RELMα+CaM抑制剂组CaM蛋白表达分别为0.24±0.08、0.62±0.20、1.41±0.33、0.45±0.33。RELMα刺激后能明显增加CaM蛋白表达，RELMα刺激组CaM蛋白高于正常对照组和阳性对照组(P均<0.05)；加用CaM抑制剂W-7后，RASMC内CaM蛋白表达降低(P<0.05)，但其表达量仍高于正常对照组(P<0.05)。

2.3 各组RASMC内MLCK蛋白表达 正常对照组、阳性对照组、RELMα刺激组、RELMα+MLCK抑制剂组蛋白表达分别为0.23±0.15、0.60±0.27、1.29±0.30、0.24±0.15。RELMα可刺激RASMC内MLCK蛋白的表达增加，RELMα刺激组MLCK蛋白表达高于正常对照组和阳性对照组(P均<0.05)；加用MLCK抑制剂ML-7， RASMC内MLCK蛋白表达降低(P<0.05)，RELMα+MLCK抑制剂组与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

RELMα作为一种脂肪细胞因子，在正常组织中表达较少，在肺动脉高压及动脉粥样硬化模型中表达升高。RELMα除具有强大的收缩血管的作用外，还有促进血管新生、增殖的作用。目前， RELMɑ在呼吸系统疾病中的研究较多，主要为该因子在肺动脉高压、肺纤维化、支气管哮喘、肺发育和代偿性增生等过程中的作用[5～7]。RELMɑ在心血管疾病方面的研究多为体外实验，RELMɑ与动脉粥样硬化进展中血管收缩与冠脉血管稳定性关系的报道甚少。本课题组在ApoE基因敲除的鼠动脉粥样硬化斑块内进行RELMɑ的RT-PCR检测和免疫组化染色发现，对比野生C57/BL小鼠，在动脉粥样硬化模型粥样斑块内明显可见RELMɑ阳性颗粒及其mRNA表达，从而证实RELMɑ在鼠动脉粥样硬化斑块内存在[3]。Teng等[8]研究表明，在缺氧的条件下肺动脉壁内RELMα表达明显上调；而在动脉粥样硬化的动脉壁内也存在缺氧，RELMα表达亦明显上调，因此研究RELMα对RASMC的收缩功能，对预防CAS患者血管痉挛、斑块破裂具有重要的临床意义。

本研究采用离体灌流血管环的方法观察了RELMα收缩血管的作用并与AngⅡ作对比，发现RELMα可引起血管收缩，其作用强于ANGⅡ，加用MLCK抑制剂后，RELMα收缩血管的作用减弱。肌球蛋白轻链(MLC)磷酸化是血管平滑肌收缩的最重要步骤之一，MLCK使MLC磷酸化，肌球蛋白磷酸化酶也使MLC磷酸化，两种机制共同调节MLC的磷酸化水平[9]。血管收缩因子与VSMC表面相应受体结合，激活磷脂酶C(PLC)，通过不同途径激活MLCK亚单位，磷酸化MLC，使VSMC产生收缩和高反应性。研究证实，RELMα刺激人类肺动脉血管平滑肌细胞后，可引起细胞内钙离子浓度升高，并进一步证实此过程是通过PLC-IP3途径实现的[10]。Chen等[11]研究提示，FIZZ1可通过上调MLCK、MLC-20的表达水平增强其对气道平滑肌的收缩反应；FIZZ1处理气道后可引起气管上皮的损伤，并激活c-Raf-ERK1/2-p38MAPK信号转导通路收缩气道平滑肌。

为进一步探讨RELMα引起大鼠主动脉血管平滑肌细胞收缩的机制，本文对血管收缩信号转导通路相关蛋白的变化进行了研究。显示RELMα刺激后大鼠主动脉平滑肌细胞内CaM、MLCK蛋白表达增加，较正常对照组和ANGⅡ刺激组均升高；加入MLCK抑制剂后，RELMα刺激引起大鼠主动脉平滑肌细胞内MLCK蛋白表达不在增高；而加入CaM抑制剂后，RELMα刺激不会引起大鼠主动脉平滑肌细胞内CaM蛋白表达降低的明显升高，但仍高于正常对照组。提示RELMα对大鼠主动脉平滑肌细胞的收缩作用可通过Ca2+-CaM-MLCK途径实现，但不是唯一途径。

综上所述， RELMα可通过Ca2+-CaM-MLCK途径引起血管平滑肌收缩，此作用可能在CAS患者血管痉挛的发生和发展过程中发挥了重要作用。