低氧预处理脂肪间充质干细胞移植对小鼠心肌梗死后心肌细胞凋亡及血管新生的影响

莫壁伶，黄子祥，黄帅，周治来

(1 广州医科大学附属第三医院荔湾医院，广州510175；2南方医科大学研究生学院；3广东省第二人民医院)

由于脂肪组织在人体存在广泛、取材方便，间充质干细胞(MSCs)具备广泛的免疫调控功能，因此脂肪间充质干细胞(ADSCs)移植已广泛应用于心血管系统、神经系统及自身免疫系统疾病治疗中[1，2]，成为修复心肌梗死的一种新策略。但是，心肌梗死后损伤局部缺氧、炎症等因素不利于细胞存活，细胞替代及细胞分化作用难以充分发挥作用[3]。低氧可以促进ADSCs对缺氧、炎症等恶劣微环境的适应能力[4]，为此，本研究通过移植低氧预处理ADSCs治疗心肌梗死小鼠，观察小鼠心肌梗死周边细胞凋亡、血管再生情况，探讨低氧预处理ADSCs移植治疗小鼠心肌梗死的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性C57B/L小鼠(南方医科大学医学动物实验中心)，DMED/F12完全培养液及0.25%胰酶(美国Gibco公司)，CO2恒温培养箱(美国Thermo 公司)，培养瓶(美国Corning 公司)，Olympus倒置光学显微镜(CK2，日本)，倒置荧光显微镜(Leica，DMIRE2 ,德国)，Ⅰ型胶原酶(美国Sigma公司)，实时荧光定量仪(ABI7500，美国)。

1.2 ADSCs分离培养及低氧预处理 取2只C57B/L小鼠腹股沟处皮下脂肪组织，PBS冲洗，Ⅰ型胶原酶消化呈乳糜状，加等量含10% FBS的DMEM/F12中和胶原酶消化；离心，弃去上清，收集细胞培养72 h 后换液，去除悬浮细胞，细胞逐渐长出，即为原代ADSCs。待原代细胞融合至80%时进行细胞传代，消化离心后用培养基重悬细胞，轻柔吹打形成单细胞悬液，按1∶3进行传代，并接种于新的25 cm2培养瓶中。取传至第3代的ADSCs，调整密度为1×105/mL，将细胞随机分为低氧组和常氧组，37 ℃条件下分别置于氧浓度为2%、21%的恒温培养箱中培养6 d。

1.3 ADSCs标志蛋白及Ki67表达阳性率检测 取对数生长期的低氧和常氧培养两组细胞，吸除培养液，以含4%多聚甲醛的PBS室温固定30 min，随后0.3% Triton室温破膜5 min，山羊血清封闭液37 ℃封闭1h。分别加入一抗兔抗Ki67(1∶100, Millipore)、小鼠抗Vimentin(1∶100, Sigma)、兔抗laminin (1∶100, Sigma)。湿盒内4 ℃孵育过夜，吸除一抗，PBS冲洗后滴加二抗Alexa Fluor 594标记的羊抗兔IgG(1∶200)和Alexa Fluor 488标记羊抗鼠IgG(1∶200)，DAPI复染细胞核，封片。荧光显微镜下随机选取5～20个高倍视野，计数相同视野下Ki67、层粘连蛋白、波形蛋白阳性染色的细胞数量，计算Ki67阳性表达率。

1.4 ADSCs心脏营养因子mRNA表达检测 ADSCs心脏营养因子如血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胎盘生长因子(PLGF)mRNA表达采用实时荧光定量PCR法。取对数生长期的低氧和常氧培养两组细胞，弃去培养液，预冷PBS洗涤单层细胞。采用TRIZOL试剂提取总RNA，检测总RNA 浓度和纯度合格后，逆转录合成 cDNA。PCR 反应过程参照前期研究。PCR反应体系Q-PCR Mix 10 μL，dd H2O 4 μL，PCR上下游引物各2 μL，cDNA(1∶5) 2 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min、95 ℃变性45 s、56 ℃退火45 s、72 ℃延伸20 s，40个循环，采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

1.5 小鼠心肌梗死模型构建及分组 选取8～10周龄20～25 g的雄性C57B/L小鼠32只，随机分成假手术组、模型组、常氧ADSCs移植组、低氧ADSCs移植组，每组8只。麻醉后开胸暴露心脏，在肺动脉圆锥与左心耳交界处下方2～3 mm处穿线，结扎冠状动脉前降支(假手术组仅在相应部位穿线但不结扎)，根据心电图ST段抬高和心肌颜色变化确定心肌梗死形成。在心肌颜色变白边缘选择3个点，模型组每个点注射10 μL PBS，常氧ADSCs移植组、低氧ADSCs移植组每个点注射分别注射10 μL常氧及低氧培养ADSCs，细胞浓度为1×105/μL。

1.6 心肌vwF、caspase-3 阳性细胞检测 细胞移植后第4周处死动物，获取心脏，PBS冲洗后放入含4%多聚甲醛的PBS中固定。石蜡包埋切片，行免疫荧光染色，分别加入一抗兔抗vwF(1∶200, abcam)、兔抗caspase-3(1∶200, Sigma)，湿盒内4 ℃孵育过夜。吸除一抗，PBS冲洗后滴加二抗Alexa Fluor 594标记羊抗兔IgG(1∶200)，DAPI复染细胞核，甘油封片。荧光显微镜下随机选取5～10个高倍视野，计数相同视野下心肌vwF、caspase-3阳性染色细胞数量。

2 结果

2.1 低氧预处理对ADSCs表面标志物表达的影响 低氧组、常氧组细胞均表达层粘连蛋白和波形蛋白，证明均符合ADSCs特性。低氧组、常氧组ADSCs Ki67表达阳性率分别为78.65%±8.55%、60.56%±5.28%，两组差异有统计学意义(P<0．05)。显示低氧组ADSCs增殖活性强于常氧组。

2.2 低氧预处理对ADSCs心脏营养因子mRNA表达的影响 将常氧组PLGF、HGF及VEGF mRNA表达量设定为1，低氧组PLGF、HGF及VEGF mRNA相对表达量分别为3.42±0.84、2.45±0.45、1.84±0.73。低氧预处理组细胞PLGF、HGF及VEGF mRNA相对表达量均高于常氧组细胞(P均<0.05)。

2.3 低氧预处理ADSCs移植对心肌梗死小鼠心肌细胞凋亡及血管新生的影响 细胞移植后4周，组织免疫荧光染色发现心肌梗死边缘区caspase-3阳性凋亡细胞每高倍视野模型组为(23.66±5.75)个，常氧ADSCs移植组为(15.83±5.45)个，低氧ADSCs移植组为(9.74±3.22)个，组间比较差异有统计学意义(P均<0.05)。心肌梗死边缘区vwF阳性血管内皮细胞每高倍视野模型组为(11.35±4.76)个，常氧ADSCs移植组为(18.95±4.55)个，低氧ADSCs移植组为(25.65±5.54)个，组间比较差异有统计学意义(P均<0.05)。

3 讨论

MSCs移植对心肌梗死具有明确的治疗作用，但其具体机制尚未完全阐明。目前研究显示其可能机制包括：MSCs分化成心肌细胞发挥细胞替代作用、MSCs分化内皮细胞促使损伤区血管再生、通过旁分泌功能分泌细胞因子促进心功能恢复等[3, 5]。且多数研究认为MSCs的旁分泌功能可能起主要作用。本研究显示，ADSCs移植可下调心肌梗死边缘细胞凋亡反应，促进新生血管再生，低氧预处理可提升ADSCs旁分泌功能，进一步发挥其对心肌梗死区周边细胞凋亡、血管再生的调控作用。

血管再生是心肌梗死后心功能恢复的关键环节。VEGF、PLGF是与血管再生密切相关的细胞因子，其中PLGF是损伤病理状态下血管再生决定性因子[6]。研究显示，在骨髓MSCs移植修复小鼠心肌梗死中，利用携带shVEGF和shPLGF的慢病毒质粒，敲低干细胞VEGF和PLGF的表达，发现下调PLGF而非VEGF时，心肌梗死小鼠心功能受影响，证实PLGF是介导心肌梗死后血管再生的关键因子[7]。因此，提升ADSCs分泌PLGF等因子的功能是提高干细胞移植修复心肌梗死的重要策略。目前，通过基因工程技术转染相关基因后再移植、药物预处理、组织工程制备细胞聚合物、低氧预处理等措施[8, 9]均是人们提升ADSCs分泌血管再生因子功能的尝试。由于氧浓度是影响细胞代谢的关键因素，低氧对MSCs增殖、分泌有重要影响，且低氧操作相对简单，故细胞低氧预处理备受关注。研究证实，低氧(5% O2)预处理MSCs显著提升细胞缺氧诱导因子1-α表达，促进MSCs增殖[10]。本研究显示，低氧组ADCSs Ki67阳性表达率高于常氧组，说明低氧处理后ADSCs增殖活性显著提升。本研究也显示，低氧ADSCs移植组 PLGF、HGF及VEGF mRNA相对表达量提升，小鼠心肌梗死周边vwF阳性血管数量较模型组和常氧ADSCs移植组增多，低氧ADSCs移植组小鼠凋亡细胞数量显著下降。此对小鼠心肌梗死后心功能恢复有重要作用。

生理状态下，人体不同组织氧含量为2%～7%，心肌梗死后梗死区及梗死周边处于无氧或严重缺氧状态，氧含量为0.4%～2.3%，不利于细胞存活[11]；其次，损伤后大量中性粒细胞、巨噬细胞等浸润，缺氧、炎症进一步导致大量细胞坏死、凋亡。研究证实，低氧预处理后干细胞氧耗量是常氧细胞的1/3，可提升MSCs对宿主损伤局部缺氧环境的适应能力。有研究显示，采用低氧预处理骨髓MSCs移植治疗大鼠糖尿病缺血肢体可促进损伤区血管再生及组织恢复[12]；低氧预处理MSCs移植在脑卒中[13]、肺损伤[14]、脑损伤[15]等疾病模型中均可发挥积极修复作用。研究发现，利用低氧预处理ADSCs条件培养液治疗心肌梗死大鼠，低氧预处理可显著提升条件培养基中VEGF、HGF、基质细胞来源因子浓度，降低损伤周边凋亡细胞数量，改善大鼠心功能[16]。低氧预处理能增强MSCs分泌缺氧诱导因子1α、VEGF、葡萄糖转运蛋白1、磷酸化Akt等因子的表达，增强 MSCs在缺血心肌组织中的存活及分泌功能，减少细胞内活性氧自由基的生成，促进大鼠缺血坏死心肌的修复[17]。

综上所述，低氧预处理增强ADSCs增殖活性，提升细胞VEGF、HGF、PLGF mRNA表达水平，低氧预处理ADSCs移植治疗心肌梗死小鼠可促进梗死边缘新生血管再生，下调凋亡细胞数量，可能是未来治疗心肌梗死的新策略。