果糖致HepG2细胞脂质沉积及ATF-4敲除的保护作用

任路平 于贤 王娜 刘娜 宋光耀 陈树春

河北省人民医院内分泌科（石家庄 050000）

近年，人群中含果糖的软饮料如可乐、果汁等的摄入量逐年增加，果糖对肝脏脂质沉积的影响已逐渐被认识。果糖主要在肝细胞内代谢，我们的既往动物研究证明高果糖饮食可引起脂肪肝，并且和肝内质网应激有关［1-3］。激活转录因子4（ATF-4）是内质网应激中非折叠蛋白反应PERK-eIF2α-ATF-4通路的下游因子，已有研究发现ATF-4具有调节脂代谢的作用［4-5］，但目前国内尚无研究观察ATF-4在果糖致肝脏脂质沉积中的作用，探讨ATF-4对果糖所致肝脂质沉积的作用有助于进一步探索果糖对脂代谢的危害及内质网应激在脂肪肝中的介导机制。故本研究通过敲低ATF-4在HepG2细胞的表达，探讨果糖致HepG2细胞脂质沉积中ATF-4的介导作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养及转染 人肝肿瘤系HepG2细胞（江苏省江阴康众康民生物医药技术有限公司，批号：HUCL-0085）用含10%FBS，1%NEAA的MEM培养液于37℃含5%CO2的温箱中培养，待细胞80%生长融合。将处于对数生长期的细胞消化后，用含10%FBS，1%NEAA的MEM培养液调整细胞密度为106个/L，转入孔板中，将ATF小干扰RNA（SiRNA）（Santa Cruz，CA，USA）转染致HepG2细胞。

1.2 细胞分组 根据不同处理将细胞分为正常对照组（C组，普通培养基培养HepG2细胞组）；高果糖组（F组，含20 mmol/L果糖的培养基培养的HepG2细胞组）；高果糖+阴性对照组（F+NC组，含20 mmol/L果糖的培养基培养的HepG2细胞转染空白对照质粒组）；高果糖+ATF-4 siRNA组（F+ATF-4 siRNA组，含20 mmol/L果糖的培养基培养的HepG2细胞转染ATF-4 siRNA组）。

x代表基带信号，M代表几进制调制，本文的M取2和4。调制信号产生以后，再给调制信号加上高斯噪声，模仿信号传输过程中的干扰。把调制信号加上高斯噪声的函数如下：

1.3 HepG2细胞甘油三酯测定 收集细胞，制备细胞悬液，将细胞悬液1 000 r/min，离心10 min，弃上清液，留细胞沉淀；按照甘油三酯测定试剂盒（普利莱基因技术有限公司）提供的操作方法，采用GPO-PAP法测定HepG2细胞内甘油三酯含量。

1.6 HepG2细胞的蛋白表达测定 本实验应用Western Blot方法测定了ATF-4及下游脂质合成的关键酶类脂肪酸合成酶（FAS）、乙酰辅酶A羧化酶（ACC）、硬脂酰CoA去饱和酶（SCD-1）的蛋白表达水平。提取HepG2细胞总蛋白，取50 μg蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，经过转膜、封闭，加入1∶1 000～1∶2 000稀释的抗体，4℃摇床过夜，TTBS缓冲液洗膜后加入1∶10 000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体孵育1 h，经化学发光，显影，定影及蛋白表达半定量分析。FAS抗体购于Santa Cruz公司，SCD-1、ACC、ATF-4抗体购于美国Cell Signal Technology公司，抗β-actin小鼠单克隆抗体购于SAB公司。

2.1 转染ATF-4 siRNA对ATF-4蛋白表达的影响 F组ATF-4表达较C组显著升高（P＜0.01），提示果糖刺激引起HepG2细胞内质网应激通路PERK-eIF2α-ATF-4的激活。F+ATF-4 siRNA组ATF-4的表达水平比F组显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01），说明ATF-4表达水平被有效抑制（图1）。