稳定表达HMGA2的人乳腺癌细胞株MDA-MB-231构建

刘娇娇，张慧变，于林

(天津医科大学，天津300070)

乳腺癌是常见严重危及女性生命的恶性肿瘤[1]，位居女性癌症发病之首。人类高迁移率族蛋白A(HMGA)家族是一类非组蛋白染色质结合蛋白，可与DNA结合导致DNA结构改变，和招募其他转录因子形成转录增强复合体，从而促进基因的转录，因而也被称为“构筑转录因子”。最初，因HMGA在SDS-PAGE胶中具有高迁移率而得名。HMGA可广泛参与染色体的结构调节、DNA的损伤修复、病毒的基因调控、逆转录病毒整合至染色体、维持干细胞的分化和自我更新、诱导肿瘤的形成、促进癌细胞代谢等细胞生命活动[2]。HMGA2是HMGA蛋白家族的成员之一，正常体细胞中表达量很低，但在胚胎发育早期和多种恶性肿瘤中均呈高表达，在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用[3]。研究[4]表明，HMGA2的表达与乳腺癌的临床病理分级呈正相关，与乳腺癌患者的生存率和预后均呈负相关，且HMGA2的异常表达可促进乳腺癌细胞的侵袭、迁移。目前实验室尚未有稳定表达HMGA2蛋白的乳腺癌细胞株。2017年9月～2018年1月，我们构建了过表达人HMGA2基因的慢病毒载体，并将其感染人乳腺癌细胞系MDA-MB-231，筛选MDA-MB-231细胞HMGA2稳定表达株，为进一步研究HMGA2在乳腺癌中的作用奠定实验基础。

1 材料

慢病毒载体质粒pLVX-IRES-Puro、包装质粒1和包装质粒2由天津医科大学生物化学与分子生物学教研室石磊教授惠赠；Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell购于北京全式金公司；MDA-MB-231购于ATCC细胞库；人肾上皮细胞系293T为本实验室保存。EcoR1和BamH1限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自Thermo Fisher Scientific公司；Prime STAR®Max DNA Polymerase购于Takara公司；Ampicillin和SYBR Green购自罗氏公司；Trans 2K PlusⅡ DNA Maker购于北京全式金公司；Puromycin、小量DNA快速回收试剂盒、质粒及快速小提试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；BCA 蛋白检测试剂盒购自 Pierce 公司；BeyoECL Plus超敏ECL化学发光试剂盒购于碧云天公司。抗体：Anti-HMGA2兔源多克隆抗体购于Abcam公司。辣根过氧化氢酶标抗鼠IgG、抗兔IgG为美国KPL公司产品。由苏州金唯智公司完成所有引物合成和基因测序工作。

2 方法及结果

2.1 重组慢病毒载体pLVX-HMGA2的构建及鉴定

2.1.1 HMGA2蛋白CDS片段获取 取适量对数生长期MDA-MB-231，提取细胞总RNA，逆转录cDNA；以cDNA为模板，根据HMGA2的CDS序列(NM_003483.4)设计含有EcoR1和BamH1限制性内切酶位点的引物序列。上游引物5′-CCGGAATTCATGAGCGCACGCGGTGAGGG-3′；下游引物5′-CGCGGATCCCTAGTCCTCTTCGGCAGACTC-3′。PCR反应体系及条件参照Prime STAR®Max DNA Polymerase说明书。扩增并回收的HMGA2蛋白CDS片段长度约为327 bp。

2.1.2 pLVX-HMGA2重组质粒构建与扩增 采用EcoR1、BamH1酶对纯化后的HMGA2蛋白CDS片段及pLVX-IRES-puro-FLAG-SND1质粒进行双酶切，电泳分离，回收酶切后产物。线性pLVX-IRES-Puro质粒载体与酶切后的HMGA2基因CDS片段具有相同黏性末端，加入T4 DNA连接酶25 ℃连接1 h，连接产物转化感受态大肠杆菌Trans1-T1，于含有氨苄青霉素抗性的LB平板上筛选克隆。挑取阳性克隆物，摇菌扩增并提取pLVX-HMGA2重组质粒。最终挑取14个阳性克隆菌株，菌液PCR电泳条带均位于327 bp左右，初步证明重组质粒PLV-HMGA2构建成功。

2.1.3 pLVX-HMGA2重组质粒鉴定 挑取1、2、3号菌落摇菌，200 rpm，37 ℃过夜。以HMGA2特异性引物为鉴定标准，将提取克隆物进行菌液PCR鉴定，2%琼脂糖凝胶电泳验证片段长度。采用限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ和BamH1对pLVX-HMGA2重组质粒进行双酶切鉴定，并以1% 琼脂糖凝胶电泳验证片段大小。同时对重组质粒进行基因测序鉴定。酶切后两条带分别位于8 140 bp左右和327 bp左右，证明HMGA2蛋白CDS序列成功插入载体。质粒PCR结果条带均位于327 bp左右，基因测序结果与HMGA2蛋白CDS序列完全一致。

2.2 MDA-MB-231细胞HMGA2稳定表达株的构建及鉴定

2.2.1 pLVX-HMGA2慢病毒质粒包装 待常规传代培养的293T细胞汇合率为70%时，将2种包装质粒同pLVX-HMGA2重组质粒在聚乙烯亚胺介导下共转染293T细胞。转染6 h后换液，转染24、48 h分别收集培养液上清，0.45 μm的滤器过滤，-80 ℃长期保存备用。

2.2.2 MDA-MB-231细胞HMGA2稳定表达株的构建 取适量对数生长期MDA-MB-231细胞，待其汇合率达60%时，将细胞分为观察组、对照组两组，观察组、对照组分别感染重组慢病毒Plv-HMGA2、空载慢病毒Plv-Vector，感染48 h加入1 μg/mL嘌呤霉素进行筛选，待MDA-MB-231野生型细胞全部死亡时停止加药，获得HMGA2慢病毒过表达稳定株。

观察组、对照组细胞HMGA2 mRNA相对表达量分别为10 273.93±4 290.77、1.18±0.81，二者比较，P<0.05。观察组、对照组细胞HMGA2 蛋白相对表达量分别为1.570±0.080、0.110±0.002，二者比较，P<0.05。

3 讨论

HMGA家族是一类通过改变染色质构象调控基因转录的非组蛋白染色质结合蛋白，包括蛋白HMGA1a(HMGI,HMGI/Y)、HMGA1b(HMGY)、 HMGA1c(HMG-I/R)和蛋白HMGA2(HMGI-C)[5]。人类HMGA2蛋白与胚胎形成、智力发育、肥胖发生等多种生理学功能有关，其在肿瘤发生发展中也具有非常重要的作用。HMGA2蛋白在恶性肿瘤中高表达，且HMGA2蛋白表达程度与肿瘤分化程度和预后相关[6]。

编码人类HMGA2蛋白的基因位于12q13-15，HMGA2基因含有5个独立外显子，均参与HMGA2蛋白的编码。HMGA2蛋白由108个氨基酸残基组成，同HMGA蛋白家族具有相同的特点，羧基端均含有酸性氨基酸残基，氨基端含有三个被11～23个氨基酸隔开的重复并保守的DNA结合结构域，能特异性地识别4～8对A、T碱基对长度的B型DNA区域，并与此AT富集区结合，因此被称为AT-hook基序。AT-hook基序是由赖氨酸、精氨酸、脯氨酸、甘氨酸、色氨酸组成的十肽结构，其核心结构由精氨酸-甘氨酸-精氨酸-脯氨酸(RGRP)组成，因此AT-hook基序也被称为RGRP基序[7]。AT-hook基序是HMGA蛋白家族的重要组成结构，是与DNA结合的结构基础。按结构可将AT-hook基序分为三部分，其核心是由精氨酸-甘氨酸-精氨酸组成的凹面结构，能完美地嵌入DNA小沟的A、T碱基对中，核心结构两端具有带正电荷的脯氨酸，能通过电荷作用与DNA骨架带负电荷的磷酸基团相结合，进一步促进HMGA2蛋白与DNA的结合，核心结构两端的精氨酸和赖氨酸残基，通过静电作用力和疏水作用力与DNA骨架相结合[8]。AT-hook模体具有三种类型，不同类型的AT-hook模体与DNA的亲和性不同，旁侧序列也不同。在与DNA高亲和的模体中，核心结构的氨基端有一个含6个氨基酸的延伸结构，与DNA小沟边缘的糖-磷酸骨架相互作用，是提高HMGA蛋白与DNA亲和性的重要结构。

人类HMGA2蛋白作为染色质结构调节蛋白,能使DNA发生弯曲等结构改变，参与细胞核内的转录调控、RNA加工、DNA修复、染色质重塑等多种生理活动，特别是在组装形成多蛋白转录调控复合体中具有重要的作用[9]。HMGA2蛋白能够直接与DNA结合，改变DNA的构象，促进转录因子与DNA的结合，形成更加稳定的DNA-蛋白复合体[6]。HMGA2作为增强子结合蛋白，其本身并不具有转录活性，而是通过与其靶基因的AT-rich区结合，并招募其他转录因子，促进靶基因的转录。研究[10]发现，HMGA2蛋白能与靶基因的启动子区结合从而促进基因转录，如HMGA2与细胞周期调控基因cyclinA的启动子区结合，促进cyclinA基因的表达。HMGA2也与靶基因的增强子区直接结合，在人类脂肪瘤中，HMGA2蛋白与IMP2基因第一个内含子处的AT-rich区直接结合，和NF-κB因子共同调节IMP2基因的表达[11]。人类HMGA2蛋白在肿瘤细胞表皮间质转化中也起着重要作用，它激活TGFβ信号通路，从而诱导人类上皮癌的侵袭和转移[12]。有研究表明，HMGA2在肾细胞癌中促进EMT,增强肿瘤细胞的侵袭迁移能力[13],HMGA2在恶性胶质瘤中增强胶质瘤细胞的多能性，促进癌细胞的增值、侵袭迁移能力，促进肿瘤的发生[14]。

HMGA2是LIN28/let-7通路重要的下游分子，let-7 是microRNA中的一个家族，具有抑制HMGA2蛋白表达的作用，HMGA2信使RNA(mRNA)的3′非编码区(3′UTR)上有7个let-7的结合位点。在人类淋巴瘤和白血病中，HMGA2基因常发生重排，形成融合基因或者缩短形式的HMGA2基因，因此HMGA2基因转录的mRNA丢失了let-7结合位点[15]。有研究表明，在人类造血干细胞发育、分化和成熟的过程中，HMGA2存在不同的可变剪接体来维持造血干细胞自我更新等功能，这些可变剪接体具有不同的3′UTR，缩短形式的可变剪接体3′UTR较短且不含let-7的结合位点，在let-7高表达的脐血源性的造血干细胞中，CLK3激酶起到调节HMGA2基因mRNA可变剪接体表达的作用，促进丢失let-7位点的mRNA表达，使得缩短形式的HMGA2蛋白高表达。在人类脂肪瘤中，也存在缩短形式的HMGA2蛋白，同HMGA2蛋白一同促进IMP2基因的表达[11]。

蛋白酶激活受1(PAR1)被认为是在乳腺癌发生及转移中起重要作用的原癌基因，研究表明，HMGA2蛋白是PAR1的重要调节因子，在人类乳腺癌中增强肿瘤细胞的侵袭能力[17]。HMGA2蛋白可能是潜在的治疗人类乳腺癌的作用靶点，Mansoori等[18]发现抑制HMGA2蛋白在人类乳腺癌细胞MDA-MB-468中的表达能够诱导细胞凋亡，HMGA2可能成为通过促进细胞凋亡和细胞周期阻滞治疗人类乳腺癌的作用位点，研究[19]同时也发现以siRNA沉默HMGA2能够增强紫杉醇的化疗敏感性。本实验以慢病毒为载体在人类乳腺癌细胞MDA-MB-231中导入外源性HMGA2基因，较用脂质体导入普通质粒更加高效和稳定。慢病毒载体是通过人类免疫缺陷1型病毒进行改造所得，能够将目的基因整合至细胞基因组中，使转染效果更稳定，同时具有能够转染分裂和非分裂细胞、不表达病毒蛋白、能够传递复杂的遗传元件等优点[20]。慢病毒载体在肿瘤基础研究和临床治疗均具有较好的应用前景。

综上所述，本研究采用重组慢病毒技术成功成功构建HMGA2基因慢病毒表达载体pLVX-HMGA2，通过嘌呤霉素筛选得到MDA-MB-231细胞HMGA2稳定表达株，为进一步研究HMGA2蛋白在乳腺癌发生发展以及临床治疗中的作用奠定基础。