中兽药芪蓝口服液水提工艺的响应面法优化

张晨，陈哲杰，甘帅，李杰，江茂源，马美伶，何瑶

畜禽感染性疾病高发，滥用抗生素类药物产生严重后果，面对抗生素耐药性及畜禽产品中的残留问题，农业部已将硫酸粘杆菌素等4种饲料用抗生素列入禁用目录。以改善现状为目标，结合当下畜牧业市场现状，禁止滥用抗生素，发展绿色畜牧业已经成为不可逆转的主流趋势。中草药饲料添加剂因具有促进生长、抗菌抑菌、改善肉品质、有害残留低等特点，符合绿色畜牧业的发展趋势，受到生产厂家和研发机构的重视。中草药防治抗病毒常以“清热解毒、扶正祛邪”为治疗原则，以清热解毒类中草药配伍具有增强机体免疫功能的中药。中兽医师经长期临床总结了芪蓝口服液处方，芪蓝口服液由黄芪、板蓝根两味中药组成，药理研究表明黄芪、板蓝根具有调节免疫力、抗炎、抗病毒等[1～2]作用，临床研究证实黄芪与板蓝根配伍在体外对猪繁殖与呼吸综合征病毒有很好抑制作用[3～4]。目前该方临床应用多为煎煮成汤剂使用，具有制备工艺混乱，质量稳定性差，安全性与有效性难以保障的缺点。

为提高芪蓝口服液提取工艺的科学性与合理性，保证药物质量稳定性，提高临床疗效，本研究采用原水提工艺，拟对水提工艺进行优化。试验选取《中国兽药典》2015版对黄芪、板蓝根规定的黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、（R, S）告依春三个指标成分的含量，同时考虑提取液的干膏收率，作为综合评分指标，在此基础上运用Box-Behnken中心设计原理结合响应面分析法对中兽药芪蓝口服液的水提工艺进行优化，从而保证芪蓝口服液提取工艺的科学性与合理性，为芪蓝口服液的进一步研究奠定基础。

1 试药与仪器

1.1 试药

黄芪甲苷对照品（批号：160329）、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品（批号：160329）、（R, S）告依春对照品（批号：160422），均购于成都普斯生物科技有限公司。甲醇和乙腈为色谱纯（美国，Sigma-Aldrich公司）；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。黄芪饮片（批号：1501003）；板蓝根饮片（批号：1503003），均购于新荷花中药饮片股份有限公司，经鉴定符合《中国兽药典》2015版标准。

1.2 仪器

Agilent1200型高效液相色谱仪（美国，安捷伦公司）；C18色谱柱（Global公司，4.6 mm ×250 mm×5 µm）；METTLER电子分析天平（十万分之一，梅特勒-托利多仪器有限公司）；RE-501旋转蒸发仪（上海耀特仪器股份有限公司）。

2 试验方法

2.1 样品制备

2.1.1 “芪蓝”水提样品的制备 称取黄芪饮片70 g，板蓝根饮片30 g，平行称取需求份数，依试验设计方案规定，分别加水（补加饮片吸水量），煎煮，合并煎煮液并滤过，以旋蒸仪浓缩至250 mL，即得水提样品，备用。

2.1.2 供试品溶液的制备 取样品液10 mL置于20mL容量瓶中，加入甲醇定容，将定容后的溶液超声处理30 min，再移取5 mL，以12000 r/min离心5 min，取上清液过0.45 µm微孔滤膜，即得。

2.1.3 对照品溶液的制备 取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，配成每1 mL含黄芪甲苷0.514 mg的准备液；分别取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品和（R, S）告依春对照品适量，精密称定，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶液溶解并定容，配成每1 mL含毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.497 mg，含（R, S）告依春0.101 mg的准备液。

2.2 色谱条件

2.2.1 黄芪甲苷 进样量20 μL；检测波长为203 nm；柱温:25 ℃；乙腈-0.1%磷酸水（33∶67）洗脱，流速为1.0 mL/min[5]。

2.2.2 毛蕊异黄酮葡萄糖苷、(R, S)告依春 进样量10 μL；检测波长：245 nm；柱温：25 ℃；流动相：A：0.1%磷酸水，B：乙腈；流速：1 mL/min，洗脱梯度：0～20 min，9%乙腈；20～22 min，9%～20%乙腈；22～55 min，20%～40%乙腈[6]。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 取黄芪甲苷对照品溶液0.25、0.5、1、2、4 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀；混合对照品溶液0.25、0.5、1、2、4 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。分别将两种不同浓度的对照品溶液按“2.2.1”“2.2.2”项下条件由低到高分别进样，测定峰面积。以进样质量浓度（mg/mL）为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程。

表1 三种指标成分的线性关系

2.3.2 精密度试验 分别按照“2.2.1”、“2.2.2”项下要求，每次取同一混合对照品溶液，分别连续进样6次，测定峰面积。结果黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、（R, S）告依春的RSD分别为 2.76% 、1.92%、1.45%。

2.3.3 重复性试验 取同一“芪蓝”水提样品按“供试品溶液的制备”项下方法平行制备6份， 相同六份供试品溶液分别按照“2.2.1”“2.2.2”项下要求分别测定峰面积。黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、（R, S）告依春的RSD分别为2.29%、1.90%、1.42%。

2.3.4 加样回收试验 精密量取欲测成分含量已知的“芪蓝”水提样品溶液5 mL，平行量取6份，3份加入“2.1.3”项下的黄芪甲苷对照品溶液适量，3份加入“2.1.3”项下毛蕊异黄酮葡萄糖苷和（R, S）告依春的混合对照品溶液适量，全部照“供试品溶液的制备”项下方法制备，并分别按照“2.2.1”“2.2.2”项下要求分别测定峰面积测定并计算回收率。黄芪甲苷的平均回收率为101.29%，RSD值为2.48%；毛蕊异黄酮葡萄糖苷的平均回收率为99.98%，RSD值为1.22%；（R, S）告依春的平均回收率为99.92%，RSD值为1.58%。

2.4 样品指标成分含量测定

取按“2.1.2”项下规定制得的待测样品溶液适量加入进样瓶，分别将仪器设定为“2.2.1”“2.2.2”项下规定的色谱条件进行指标成分峰面积测定，并分别根据标准曲线计算指标成分含量。

2.5 干膏率测定

精密量取各试验组的水提样品液50 mL，分别置于干燥至恒定重量的蒸发皿中，于水浴锅上105 ℃水浴蒸干至恒定重量，置干燥器中冷却至室温，后迅速精密称取重量，并计算干膏收率。

2.6 单因素试验及响应面法试验中芪蓝口服液水提参数的综合评分方法

综合评分（Y）满分为100分，根据方中用药量及君臣关系，划分黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、（R, S）告依春、及干膏收率的权重分别为30、30、25、15。在此基础上得到加权综合评分公式：Y=Y1/Y1Max×30+Y2/Y2Max×30+Y3/Y3Max×25+Y4/Y4Max×15，其中Y1为每个试验样品重复取样3次测得黄芪甲苷质量浓度和的平均值，Y1Max为样品中黄芪甲苷质量浓度的最大值；Y2是每个试验样品重复取样3次测得的毛蕊异黄酮葡萄糖苷质量浓度平均值，Y2Max为样品中毛蕊异黄酮葡萄糖苷质量浓度的最大值；Y3为每个试验样品重复取样3次测得的（R, S）告依春质量浓度平均值，Y3Max为样品中（R, S）告依春质量浓度的最大值；Y4为每个试验样品重复取样3次测得的干膏率，Y4Max为样品中干膏率最大值。

2.7 水提工艺的单因素试验及结果

2.7.1 单因素试验 通过单因素试验，在其他提取条件不变的情况下，分别考察提取时间、料液比、提取次数对黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、（R, S）告依春的含量及干膏收率对综合评分的影响。

表2 单因素试验设计水平

2.7.2 单因素试验结果

提取时间对综合评分的影响 单因素试验分别考察了煎煮0.5、1、1.5、2、2.5、3 h对指标成分及干膏收率的影响，结果（见图1）表明，按照“综合评分方法”随着煎煮时间的延长，综合评分逐渐升高，0.5～1.5 h最为明显，其后趋于平稳，为兼顾提取效果与能源节约，本试验将提取时间控制在1.5～2.5 h内。

提取次数对综合评分的影响 单因素试验分别考察了提取1、2、3、4、5次对指标成分及药效作用的影响，结果（见图1）表明，按照“综合评分方法”随着提取次数的增加，获得的综合评分逐渐升高，提取1～3次综合评分上升明显，3次以后评分提高不明显。考虑到节约能源与缩短提取时间，最后确定提取次数控制在1～3次范围内。

料液比对综合评分的影响 单因素试验分别考察了料液比为1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12对指标成分及药效作用的影响，结果（见图1）表明，按照“综合评分办法”随着加水量的增加，获得的综合评分逐渐升高，料液比为1:7～1:9时评分上升明显，料液比大于1:9以后评分变化趋于稳定。综合考虑后确定料液比应控制在1:9～1:11范围内。

图1 煎煮时间、煎煮次数、料液比多芪蓝口服液提取工艺评分的影响

2.8 水取工艺的响应面法优化试验及结果分析

2.8.1 响应面法试验 根据Box-Behnken中心组合设计原理，参考单因素试验结果，选取提取时间（A）1.5、2、2.5 h；提取次数（B）1、2、3次；料液比（C）1:9、1:10、1:11作为考察对象，以黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、（R, S）告依春的含量及干膏收率的综合评分为响应值，采用Design Expert8.0.6统计分析软件的响应面分析法设计试验，研究其对芪蓝口服液提取的影响，以得到芪蓝口服液的最佳水提工艺。本试验采用3因素3水平的响应面法试验进行设计见表4，响应面法试验方案及结果见表5。2.8.2 数学回归分析 运用统计软件Design Expert 8.0.6对表5中各试验组综合评分进行多元回归拟合，得综合评分对自变量A、B、C的二次多元回归方程为Y=90.85+1.66A+12.04B+0.20C-2.02AB-0.32AC-0.33BC-0.69A2-3.43B2-1.35C2，所建立的二次多项式模型具有高度的显著性（P＜0.0001），模型决定系数R2= 0.9819，表明模型拟合度良好，方差分析及回归系数显著性检验结果见表6。

表4 Box-Behnken中心组合设计因素水平

表5 响应面法试验方案及结果

表6 数学回归分析结果

利用Design-Expert 8.0.6软件，根据拟合模型绘制不同影响因素对综合评分的三维曲线图与等高线图，（见图2、3）。由图2、3结合表6中A、B、C三个因素的F值大小可得三个因素对综合评分的影响大小为B＞A＞C。提示，在本试验各因素的考察范围内优选提取工艺，因素A与因素B对评分影响较大，应首先考虑提高因素B（提取次数）的水平，其次是提高因素A（提取时间）的水平，而因素C(料液比)对综合评分影响最小，料液比应适当控制，以避免实际生产中对提取液的浓缩环节耗费更多能源，增加生产成本。

图2 各因素交互作用对综合评分影响的三维效应面图

图3 各因素交互作用对综合评分影响的等高线图

在响应面模型的基础上，利用Design-Expert 8.0.6软件对提取工艺参数的二次回归方程求解，得水提工艺：提取时间（A）为1.5 h，提取次数（B）为3次，料液比（C）为1∶9.84。参考拟合模型数学回归分析中三个因素对综合评分影响的分析结果，为节约实际生产成本与实际操作方便将二次回归方程求解工艺参数加以修正，得最优工艺：提取时间（A）为1.5 h，提取次数（B）为3次，料液比（C）为1∶9。

2.9 提取工艺验证试验

按照处方量称取药材，平行称取5份，运用Box-Behnken响应面试验所得的最佳水提工艺进行药材的提取，验证试验结果见表7。试验结果与模拟值基本接近，各试验组与理论值相对误差均小于0.97%，表明模型预测值与真实值间拟合度良好，同时5组试验综合评分的RSD值为0.62%，表明所采取水提工艺具有较好的稳定性，进一步印证了该工艺的可靠性。

表7 提取工艺验证试验结果

3 结论

本研究根据芪蓝口服液处方的药材比例及君臣关系分别将黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、（R,S）告依春及干膏收率的综合评分权重设为30、30、25、15，使得综合评分更加合理，能较为合理的体现提取工艺对药材提取效果的影响，在此基础上利用Box-Behnken响应面法在中药复方研究中的优势，初步得出水提工艺，并根据实际生产需要对工艺进一步优化，最后确定出芪蓝口服液的最佳提取工艺为：取处方量药材，提取3次，每次加9倍量水，一次1.5小时。所得最佳工艺简便可行、结果稳定。

目前，对黄芪、板蓝根及其复方的提取工艺研究中，正交试验是采用较多的方法。本文采用Box-Behnken响应面法优化中兽药芪蓝口服液的水提工艺，避免了正交设计、均匀设计等方法的不足，使试验所得的最佳水提工艺更具科学性，为芪蓝口服液的进一步研究奠定了基础。