基于Plackett-Burnman设计和Box-Behnken效应面法优化南宝戒毒清胶囊提取工艺

管志美，彭艳梅，王银，王兴国，彭宇，李跃辉*

南宝戒毒清胶囊系由湖南省中医药研究院和邵阳市中医解毒研究所联合研发的新型毒品戒断药，自2010年以来，临床应用于毒品戒毒2500多例，疗效确切。产品处方是由黄芪、远志、党参、人参、柏子仁等二十一味中药组成的临床经验方，具有扶正固本，补气安神，解痉止痛，镇惊熄风之功效，临床适用于因吸食阿片类毒品或甲基苯丙胺类毒品有戒断症状综合症状者。本文拟采用Plackett-Burnman设计联合Box-Behnken效应面法对南宝戒毒清胶囊提取工艺进行优化，为后期产品的大生产及临床应用研究提供可行性依据。

1 仪器与试药

Agilent-1260高效液相色谱仪（ELSD-UM4800型蒸发光散射检测器）；岛津LC-20AT高效液相色谱仪（SPD-20A检测器，LC-20A泵，LC-20B泵）；色谱柱（依利特Hypersil ODS2 ，4.6mm×250mm，5μm）；HD-200型高速多功能粉碎机（诸暨市海道机械有限公司）；DK-98-Ⅱ电热恒温水浴锅、101-2AB型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；AL204电子分析天平（北京赛多利斯仪器有限公司），YP5102电子天平（上海光正医疗仪器有限公司）。

黄芪、远志等药材均购于湖南省自然堂中药饮片有限公司，经湖南省中医药研究院中药研究所鉴定室鉴定，均符合《中国药典》2015年版一部各药材项下相关规定；乙腈、甲醇（一级色谱纯Honeywell Burdick & Jackson）；水为重蒸馏水；黄芪甲苷对照品、细叶远志皂苷对照品（批号：110781-201717、111849-201705，均由中国食品药品检定研究院提供）；其他试剂均为分析纯。

2 试验方法及结果

2.1 浸膏得率的测定[1]

按处方比例称取黄芪、远志等药材共93.6 g，加水提取，滤过，合并滤液，减压浓缩至一定体积。精密量取浓缩液适量，置己干燥至恒重的蒸发皿中蒸干，于105℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称重，计算浸膏得率。

2.2 黄芪甲苷的含量测定[2～3]

2.2.1 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-水为流动相，梯度洗脱，洗脱程序见表1，流速为0.8 mL﹒min-1，柱温：25 ℃；蒸发光散射检测器检测，蒸发温度100 ℃，雾化温度95 ℃，气体流速为2.8 L﹒min-1，增益值为1.0。理论板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4000。

表1 梯度洗脱程序

2.2.2 对照品溶液的配制 取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.49 mg的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密量取浓缩液适量蒸干，加水10 mL，微热使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40 mL，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水5 mL使溶解，放冷，通过D101型大孔吸附树脂（内径为1.5 cm，柱高为12 cm），以水50mL洗脱，弃去水液，再用40%乙醇30 mL洗脱，弃去洗脱液，继用70%乙醇80 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.2.4 测定 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液溶液各10 μL注入液相色谱仪，按照“2.2.1”项下色谱条件测定。

2.3 细叶远志皂苷的含量测定[4～5]

2.3.1 色谱条件 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.05%磷酸溶液(72：28为流动相，流速为1mL﹒min-1，柱温：25 ℃；检测波长为210 nm。理论板数按细叶远志皂苷峰计算应不低于3000。

2.3.2 对照品溶液的配制 取细叶远志皂苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.42 mg的溶液，即得。

2.3.3 供试品溶液的制备 精密量取浓缩液适量蒸干，精密加入70%甲醇50 mL，称定重量，超声处理1 h，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，置圆底烧瓶中，蒸干，残渣加10%氢氧化钠溶液50 mL，加热回流2 h，放冷，用盐酸调节pH值为4～5，用水饱和的正丁醇振摇提取3次，每次50 mL，合并正丁醇液，回收溶剂至干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

2.3.4 测定 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液溶液各10 μL注入液相色谱仪，按照“2.3.1”项下色谱条件测定。

2. 4 Plackett-Burnman试验设计筛选主要影响因素

2.4.1 因素及水平[6]在实际大生产中，影响提取工艺的因素包括药材粒度、提取次数、浸泡时间、提取时间、提取溶剂及溶剂用量等，本课题在前期的初步研究中采用了水提，确定了溶剂种类。故现以黄芪甲苷提取量（mg）和细叶远志皂苷提取量（mg）作为考察指标，运用Design-Expert8.0.5.软件进行Plackett-Burnman设计，对药材粒度、提取次数、浸泡时间、溶剂用量、提取时间进行考察。根据前期试验结果设每个因素高低2水平，用1、-1表示。因素水平见表2，试验设计及结果见表3。

表2 Plackett-Burnman设计因素水平表

表3 Plackett-Burnman设计试验安排及结果

2.4.2 模型的建立及分析 运用Design-Expert8.0.5.软件对表3中数据进行拟合、回归分析和F检验，结果见表4。

表4 Plackett-Burnman设计模型方差分析

由表4可知，模型显著；X2/提取次数、X4/溶剂用量、X5/提取时间对黄芪甲苷和细叶远志皂苷的提取量影响均显著；各显著性影响因素大小顺序为X4/溶剂用量＞X5/提取时间＞X2/提取次数，其他两个因素包括药材粒度、浸泡时间显著性不明显，故选择溶剂用量、提取时间和提取次数作为Box-Behnken效应面法中的考察因素。

2. 5 Box-Behnken效应面法优选提取工艺[7～8]

2. 5. 1 设计方案与试验结果 因为提取次数不是连续变量，故在本试验中，提取时间设为总提取时间、溶剂用量则为溶剂总用量，结合Plackett-Burnman试验设计筛选出的因素，选取提取次数、提取总时间和溶剂总用量3个因素为考察因素，分别以A、B、C表示，每个自变量的低中高水平分别以-1、0、1进行编码，自变量及水平见表5。以黄芪甲苷提取量、细叶远志皂苷和干膏率为评价指标，采用软件Design-Expert8. 0. 5中的Box-Behnken试验设计优选最佳提取工艺参数。方案及试验结果见表6。

表5 自变量及水平

表6 Box-Behnken试验设计及结果

2. 5. 2 数据处理及模型的拟合 多指标数据处理常采用总评“归一值”（OD）法，对取值越小越好的指标di=(ymax-yi)/(ymax-ymin)，对取值越大越好的指标di=(yiymin)/(ymax-ymin)，OD=（d1d2d3……dn）1/n，i=1，2，3…，n，n为指标数。运用Design-Expert8.0.5.软件，以OD值为响应值对各因素进行多元线性回归和二项式拟合，对OD值进行方差分析，结果见表7。

表7 Box-Behnken试验设计的方差分析

A2 1 0.042 0.042 4.11 0.0824 B2 1 0.089 0.089 8.76 0.0211 C2 1 9.563E-003 9.563E-003 0.94 0.3643残差 7 0.071 0.010失拟检验 3 0.051 0.017 3.29 0.1402纯误差 4 0.021 5.132E-003总误差 16 1.42

利用Design-Expert8. 0. 5软件对表5数据进行多元回归拟合，得OD值对提取次数(A)、提取总时间(B)及溶剂总用量(C)的二次多项回归模型：OD=0.60+0.10A+0. 090B+0. 36C－0. 041AB－0.048AC－0.002375BC－0.100A2－0. 15B2+0.048C2，（r= 0.9500），模型具有显著性（P=0.0009＜0.05），失拟项不显著（P=0.1402＞0.05），表明模型拟合度较高，回归方程误差较小。

2.5.3 效应面分析及Box-Behnken试验模型预 根据回归方程分析结果，运用Design-Expert8. 0. 5软件，固定3个自变量中的任意一个绘制其他2个自变量对响应值（OD值）影响的等高线图和三维曲面。见图1-3。

图1 提取次数和提取总时间对OD值影响的等高线和响应面图（左等高线，右响应面）

图2 提取次数和溶剂总倍数对OD值影响的等高线和响应面图（左等高线，右响应面）

图4 提取总时间和溶剂总倍数对OD值影响的等高线和响应面图（左等高线，右响应面）

2.5.4 南宝戒毒清胶囊提取工艺参数的预测及验证利用Design-Expert8. 0. 5软件根据拟合的效应面及等高线图，结合二次回归模型，预测南宝戒毒胶囊的最佳提取工艺参数为提前次数为2.22次，提取时间为3.77小时，溶剂总倍数为22.00倍，OD值为1.02483。考虑到大生产的可操作性，将工艺优化为：加水提取2次，第一次加水12倍，提取2小时；第二次加水10倍，提取1.5小时。

称取南宝戒毒清胶囊1000粒的处方量药材，按优化后的工艺参数提取，并进行浸膏得率和黄芪甲苷、细叶远志皂苷提取量的测定，平行试验3次，结果见表7。

表7 验证试验结果

试验结果表明测定的OD值与理论OD值相近，RSD%为0.73%，表明模型的预测性较好且该提取工艺重复性较好。

3 讨论

中药及其复方中提取工艺的优劣直接关系到临床疗效。常见的提取工艺优化包括单因素试验、正交试验等，这些方法往往存在试验组数量少，精密度不佳等问题，导致试验结果准确性不高、可靠性低，已不太实用。因此寻找更好、更可靠、更有效的试验研究方法成为当下的关键。Plackett-Burnman是一种主要针对因子数较多，且未确定众因子相对于响应变量的显著性而采用的筛选试验设计方法，通过比较各因子两水平的差异与整体的差异来确定因子的显著性，从而达到筛选的目的，避免后期优化试验中由于因子数太多或部分因子不显著而浪费试验资源[9]。Box-Behnken效应面法是一种因素与响应值之间显非线性关系的试验设计方法，不使用点而采用多元线性和二次项模型拟合，从而保证所有的因素落在一个均匀地水平，能较好地体现依赖变量与非依赖变量之间的关系，利用软件的拟合可以对回归方程的分析寻求最佳工艺参数[10]。本文通过Plackett-Burnman设计结合Box-Behnken效应面法优选出了南宝戒毒清胶囊的最佳提取工艺，经验证与预测值接近，证明所选的提取方法合理、可行。