六神曲发酵前制备工艺研究

张红玲，覃艺，孙佳彬，范润勇，黄勤挽 ，孙继林，姚仁川

六神曲又名六曲、神曲，最早收载于《药性论》：“化水谷宿食、结积滞，健脾暖胃”。六神曲以面粉麦麸为发酵基质，加入苦杏仁、赤小豆，以青蒿、辣廖、苍耳草煎煮的汁液混匀后发酵而成。主治功效为健脾和胃，消食调中。用于脾胃虚弱，饮食停滞，胸痞腹胀，小儿食积，临床应用广泛。作为一种传统的复方曲剂，其物质基础和作用机制并不十分明确，目前药典尚未收载该品种。虽然有一些地方标准收载六神曲，但是各地发酵工艺、炮制工艺存在较大差异，且并没有统一的质量标准[1]。目前关于六神曲发酵工艺研究较多，而且工艺的统一初具模型，然而在发酵前原药材的处理上尚没有明确的规定，也没有相关研究，本实验以此为依据，进行了一系列的探索，以期为六神曲的发酵工艺控制和质量标准统一提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 实验材料

药材：苦杏仁、赤小豆、青蒿、辣廖、苍耳草，上述饮片均由四川辅正药业有限责任公司提供。

试剂试药：芦丁对照品（批号151023）、槲皮素对照品（批号150302）、绿原酸对照品（批号140601），均由成都普菲德生物技术有限公司提供；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、甲醇、乙醇等有机试剂均为分析纯。

1.2 实验仪器

FW135 型中草药粉碎机( 上海隆拓仪器设备有限公司)、UV-6100型紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）、ZDHW型电热套（北京中兴伟业仪器有限公司）、FA1204C型万分之一电子天平（上海越平科学仪器有限公司）、DHG-9240型电热恒温鼓风干燥箱（上海将任实验设备有限公司）、HHS-8S型电子恒温不锈钢水浴锅（上海宜昌仪器纱筛厂）、RE-2000B型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）。

2 方法与结果

2.1 苦杏仁赤小豆粉碎工艺研究

按照六神曲标准，需将苦杏仁、赤小豆粉碎成粗粉。《中国药典》对于粗粉的定义为：全部通过二号筛但混有通过四号筛不超过40%的粉末，故粉碎中过粗或者过细均不适合。

2.1.1 实验方法 采用单因素试验法，对苦杏仁、赤小豆采用单独粉碎和混合粉碎的方法进行考察，以粉碎成恰当合格率为指标，设计试验如下：

（1）取苦杏仁、赤小豆各100g，置杯式粉碎机中，分别粉碎1min、2min、3min……直至粉末合格率达标。

（2）取苦杏仁、赤小豆各50g，混合，置杯式粉碎机中，粉碎1min、2min、3min……直至粉末合格率达标。

2.1.2 实验结果结果见表1。

表1 苦杏仁、赤小豆粉碎工艺研究

从表1可见，单独粉碎时，苦杏仁较难粉碎过筛，所需时间长且回收率较低；而赤小豆较易粉碎，但是容易细粉过多，不符合粗粉要求。混合粉碎时，不至于过快粉碎导致细粉过多，较好控制粉碎程度，且粉末收得率高。在高速杯式粉碎机中，每100g样品（苦杏仁、赤小豆各50g混合均匀），粉碎1min即可。工业大生产中，一般采用万能粉碎机，将苦杏仁、赤小豆适量，等分混合均匀，采用2号筛网，粉碎通过即可。

2.2 辣蓼、青蒿、苍耳草煎煮工艺研究

2.2.1 煎煮工艺设计 正交试验以出膏率及成分提取率为指标，影响因素有加水量、浸泡时间、煎煮时间、煎煮次数等，设计4因素3水平的正交试验。按照六神曲标准的要求，制法中已经规定了煎煮时间为1小时，煎煮次数为1次，故不再作为筛选考察指标。取青蒿、辣廖、苍耳草各约33.3g(合计100g），混合均匀，因素水平表见2。

2.2.2 含量测定 （1）对照品溶液的制备精密称取槲皮素（绿原酸1mg）对照品10mg，用95%乙醇溶解并定容到10mL，超声充分溶解即得1mg/mL的槲皮素(绿原酸)对照品溶液，备用。

（2）供试品溶液的制备取0.5mL原煎煮药液，加无水乙醇定容到10mL，摇匀后超声10min，过滤，取滤液作为供试品溶液备用。

（3）标准曲线的制定分别吸取对照品溶液0、0.5、1、1.5、2、2.5mL于6个25mL容量瓶中，用95%乙醇定容到25mL；以加入0mL对照品的溶液作为空白溶液，在370nm处测定吸光度，并以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标作标准曲线，得回归方程。

（4）含量测定以加入0mL对照品的溶液作为空白溶液，直接将供试品溶液在370nm处测定吸光度，计算各供试品槲皮素、绿原酸含量。

原药液中槲皮素含量=所测得槲皮素含量*1000mL/0.5mL

原药液中绿原酸含量=所测得绿原酸含量*1000mL/0.5mL

2.2.3 干膏率测定 精密量取25mL上述煎煮药液，置于已恒重的蒸发皿中，水浴加热挥干，于105℃烘箱干燥至恒重,称定重量，计算出膏率，每组平行2份，计算平均值。

干膏率=(干膏重*1000mL/25mL)/原药材重100g*100%

2.2.4 评价指标 以槲皮素、绿原酸的含量以及干膏率进行综合评分为指标。权重系数分配为：出膏率（权重20%）、槲皮素含量（权重40%）、绿原酸含量（权重40%）。正交试验结果见表3，方差分析结果见表4。

2.2.5 试验结果 从表3可知，以综合评分为考察指标时，A3＞A2＞A1，B2＞B1＞B3，C和D为定值。从表4可知，4个因素中，因素B（浸泡时间）对煎煮整体评分有显著影响。因此辣蓼、青蒿、苍耳草的最佳煎汁工艺组成为A3B2，而C、D因素为定值，即加入12倍水量，浸泡30min，加热至沸腾后煎煮1h，煎煮一次。

表2 L9(34)因素水平表

表3 L9(34)正交实验结果

表4 方差分析结果

2.3 浓缩工艺研究

2.3.1实验方法 按部颁六神曲标准规定，取六神曲发酵其他固体成分处方量，逐渐加入提取药液，每次加入100mL，直至制成符合“揉之成团，触之即散”标准的软材。确定符合条件所需药液的范围。

2.3.2 试验结果 浓缩终点的判断见表5。

从表10可见，在药液500～800mL范围内，制备的软材情况较好。故标准处方量下制备软材所需液体量范围为500～800mL。按12倍加水量记（不考虑药材吸附和煎煮损失），药液需浓缩33.3%～58.3%。

3 结论与讨论

六神曲作为传统发酵类中药，发酵时各种条件变化都会影响其成品质量。然而目前六神曲并没有统一的质量标准，不同地区标准中，其生产工艺也存在较大差异。本实验针对六神曲制备，对其发酵前期工作进行标准量化统一，以期规范六神曲生产工艺。提高市场上六神曲产品质量，保证其药效。

《卫生部药品标准中药成方制剂第十九册》六神曲标准规定：原料药七味，苦杏仁、赤小豆粉碎成粗粉，与面粉、麦麸混匀，另取辣蓼、青蒿、苍耳草加水煎煮1小时，滤过，滤液浓缩成清膏，趁热与上述药粉拌匀。

现优化工艺为以上七味，苦杏仁、赤小豆混合，过2号筛粉碎成粗粉，与面粉、麦麸混匀，另取辣蓼、青蒿、苍耳草加12倍量水，浸泡30分钟，煎煮1小时，用200目滤布板框滤过，滤液浓缩成清膏（原生药6.5倍量水），趁热与上述药粉拌匀。