冬虫夏草人工菌丝体体外抗肿瘤试验研究

孟亚鹏，陶宏凯，曾佑琴

根据世界卫生组织统计每年球每年死于癌症患者高达700万，其死于胃癌患者占了70万例，我国胃癌患病率和死亡率是世界平均水平2倍多。胃癌初期无明显症状，至发现经常处于中晚期，现有的放、化疗手段难以根本解决问题。利用传统的中医药寻找治疗胃癌的新药和手段是目前的一个热点[1]。

冬虫夏草是一种复合物，由冬虫夏草菌寄生于虫草蝙蝠蛾的子座及幼虫尸体上形成，中医认为冬虫夏草味甘、性温暖、益腰肾、止咳痛、补虚损、益精气。目前的研究也显示冬虫夏草具有抑制肿瘤、促调节免疫等作用。天然虫草生长海拔较高，周期长，产量小，因此价格昂贵。从冬虫夏草菌种分离培养的虫草菌，可以看做冬虫夏草的代替品，化学成分分析表明，虫草菌中的虫草酸、虫草多糖，其活性与天然冬虫夏草无明显差别[2]。因此利用虫草菌丝体代替天然的冬虫夏草，并进行体外抗肿瘤研究，意在明确冬虫夏草人工菌丝体对肿瘤的作用效果和药理机制，为冬虫夏草人工菌丝体资源的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人工菌丝体购至浙江万丰企业集团制药有限公司发酵虫草菌粉，供试胃癌细胞为人胃癌细胞株SGC-7901，试验药品、RPMI-1640培养基、胎牛血清、双抗、胰酶与EDTA消化液、MTT等；试验仪器有超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、分光光度计、培养板等。

1.2 方法

1.2.1 冬虫夏草人工菌丝水提物的方法 采用自动煎药机讲购买的虫草菌粉制成水煎液，调整水煎液的pH 到7.3～7.4，然后采用32层纱布过滤，15000 r﹒min-1离心20 min，上述操作重复一次，吸取上清，采用过滤除菌的方法收集过滤液，4℃密封保存备用。

1.2.2 冬虫夏草人工菌丝水提物的处理 获取的冬虫夏草人工菌丝水提物设置3个质量浓度组(10、100、1000 μg﹒mL-1)，用环磷酰胺设置阳性，用无菌蒸馏水配置成0.5 μg﹒mL-1溶液，过滤除菌。

1.2.3 细胞培养 SGC-7901细胞培养采用RPMI-1640培养基培养，培养基添加1 5%的胎牛血清和1%双抗。消化呈单个细胞采用0.25%的胰酶和0.02%EDTA(1∶1)，细胞消化后进过稀释然后进行计数，以103、104个细胞进行接种培养。

1.2.4 细胞增殖活性的检测 SGC-7901细胞增殖活性检测采用MTT法，利用MTT检测细胞增殖的抑制率。加入冬虫夏草人工菌丝水提物的细胞培养48小时后，弃培养基，加入MTT进行显色。利用分光光度计测定570 nm的吸光率。细胞数量以光密度值（OD）来表示，OD值越高，表示细胞增殖活性越强。抑制率=(对照组OD值-给药组OD值)/对照组OD值*100%[3～4]。

2 结果与分析

2.1 冬虫夏草人工菌丝水提物对SGC-7901细胞生对长的影响

表1 冬虫夏草人工菌丝水提物对SGC-7901细胞生长的抑制作用

从表1可以看出，冬虫夏草人工菌丝水提物对SGC-7901细胞的抑制效果较好，冬虫夏草人工菌丝水提物10、100、1000 μg﹒mL-1三个剂量组和环磷酰胺组处理的OD值均明显低于对照组，冬虫夏草人工菌丝水提物对SGC-7901细胞的抑制率和冬虫夏草人工菌丝水提物的量有关，加入冬虫夏草人工菌丝水提物量越大抑制的效果随之加强，此结果显示冬虫夏草人工菌丝水提物对SGC-7901细胞的毒性呈剂量依赖关系。且冬虫夏草人工菌丝水提物1000 μg﹒mL-1和环磷酰胺组对SGC-7901细胞抑制率均达到75%以上，效果较好。

3 结论与讨论

冬虫夏朝中的有效成分主要是多种蛋白质，抗真菌抗生素和真菌多糖，研究表明这些物质对腹水瘤有明确的抑制作用。冬虫夏草中的真菌多糖、虫草酸对人体免疫系统有促进作用，可以提高骨髓细胞的造血功能，促进红细胞的产生，对抗白血病和粒细胞的减少，也能抑制癌细胞的分裂，防止癌细胞扩散，增强巨噬细胞吞噬能力[5～6]。对青海产天然冬虫夏草（特级）、四川产天然冬虫夏草 (二级)、虫草头孢菌丝粉和虫草菌丝浸膏进行了的成分分析表明，四个样品中氨基酸的种类都是17种，其中谷氨酸含量最高，胱氨酸含量最低，四种样品人体必需氨基酸含量一样丰富，总氨基酸含量稍有差异外，氨基酸属性基本一致，说明冬虫夏草人工菌丝体与冬虫夏草的成分基本一致，研究冬虫夏草菌丝体可以解决冬虫夏草数量少、价格昂贵的的问题。

本研究用冬虫夏草人工菌丝体水提物对SGC-7901细胞进行了体外试验，采用了MTT法检测了药物作用对SGC-7901细胞的增殖抑制效果，结果发现冬虫夏草人工菌丝体水提物对SGC-7901细胞抑制效果较好，尤其在冬虫夏草人工菌丝体水提物在高剂量1000 μg﹒mL-1时，抑制的效率可以到到76.48%。由此推论，冬虫夏草人工菌丝体水提物抑制癌细胞的可能机制是通过提高机体免疫能力而间接影响癌细胞，而不是直接作用于癌细胞将其杀死，只是抑制了细胞的增殖[7]，后期的实验需要在瘤株动物中进行后续的研究，为冬虫夏草人工菌丝体的开发和利用提供依据。