酱油渣异黄酮抗氧化功效成分纯化研究

黄福气， 于志成， 刘步青， 许 宙， 焦 叶，崔 波， 邹飞雪， 藏庆佳， 程云辉*，

（1.长沙理工大学 化学与食品工程学院，湖南 长沙410114；2.齐鲁工业大学（山东省科学院）食品科学与工程学院，山东 济南250353；3.烟台双塔食品股份有限公司，山东 烟台265404）

酱油发酵后经淋油或抽油产生的剩余残渣即为酱油渣[1]。据中国调味品协会统计，仅2017年我国酱油产量接近860万吨[2]，按照每生产1吨酱油产生0.67吨酱油渣计算[3]，酱油渣年产生量可达580万吨。酱油渣中不仅含有蛋白质、脂肪、糖类等营养成分[4]，还含有大量的大豆异黄酮、皂苷、低聚糖、膳食纤维、磷脂等生物活性物质，是一种廉价的生物资源，尤其是其中的大豆异黄酮，它主要以苷元形式存在，具有很好的生物活性[5]。然而，国内大多将酱油渣用作价格低廉的饲料或肥料，甚至当作废渣丢弃，造成了严重的资源浪费和环境污染[6]。因此，酱油渣中异黄酮类化合物提取工艺及纯化方法的研究具有非常重要的意义。

大豆异黄酮属于黄酮类化合物中的异黄酮类，是大豆生长过程中的主要次级代谢产物之一[7-10]，同时还是一种天然植物雌激素，具有多种生物活性作用。大豆异黄酮除具有抗氧化作用外[11]，还有改善妇女更年期综合征[12-13]、预防心血管疾病、预防骨质疏松[14]、抗癌[15]、抗炎[16-17]、抗菌[18]等作用，在保健品、医药、化妆品等领域被广泛应用。有研究表明酱油渣中异黄酮抗氧化活性高于大豆[19]，而且异黄酮不溶于水的特点使其在酱油酿造过程中仅有小部分异黄酮流失，大部分异黄酮仍残存于酱油渣中[20]。因此，采用合适的提取纯化方法从酱油渣中提取异黄酮，可使酱油渣资源得到更高值化利用。沈春华[21]利用超声波结合乙醇提取法从酱油渣中提取大豆异黄酮，所获得的异黄酮粗提物中异黄酮质量分数为1.09%。何隽婷等[22]采用NKA9树脂对酱油渣中大豆异黄酮进行纯化，所得到的产品纯度可达到32%，但仍然不能满足商品化异黄酮纯度不低于40%的市场要求。

作者以酱油渣为原料，拟采用乙醇溶剂提取法，通过单因素试验优化提取条件；从6种方法中筛选出效果较佳的方法进行联用，以提高异黄酮产品纯度。同时通过对超氧阴离子和DPPH自由基清除能力的考察对其抗氧化性能进行评价，为进一步开发利用酱油渣资源提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

酱油渣由加加酱油集团提供；大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素、大豆黄素、大豆黄苷（纯度均大于98%）：中国科学院成都生物研究所产品；乙腈（色谱纯）、甲酸（色谱纯）、乙酸乙酯（分析纯）、二氯甲烷（分析纯）、正丁醇（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司产品。

1.2 仪器与设备

FA2004N电子分析天平：上海精密科学仪器有限公司产品；HH数显恒温水浴锅：金城国胜实验仪器厂产品；旋转蒸发仪：上海常豫仪器有限公司产品；LGJ-18C冷冻干燥机：北京四环科学仪器厂有限公司产品；TDL-5-A离心机：上海安亭科学仪器有限公司产品；TG16-WS台式高速离心机：湘仪离心机仪器有限公司产品；UV1800紫外可见分光光度计：日本岛津公司产品；Waters 2695高效液相色谱仪：美国Waters公司产品；KQ5200B型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司产品；新型密封式粉碎机：上海烨昌食品机械有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 酱油渣的预处理 将酱油渣在60℃烘箱中烘干，再用粉碎机将其粉碎（过60目筛），脱脂，干燥备用。

1.3.2 酱油渣中基本成分的测定 水分质量分数的测定：参考《GB 5009.3-2016》恒重法；蛋白质质量分数的测定：参考《GB/T 6432-2018》的凯氏定氮法；脂肪质量分数的测定：参考《GB 5009.6-2016》的索氏提取法；灰分质量分数的测定：参考《GB 5009.4-2016》的干法灰化；总糖质量分数的测定：参考《GB/T 15672-2009》的苯酚硫酸法。

1.3.3 大豆异黄酮含量的测定

1）HPLC测定条件 参考文献[23]，稍有修改。色谱柱：XBridge®C18；流动相：体积分数0.1%甲酸溶液（A）、乙腈（B）；流量：0.3 mL/min；检测波长：260 nm；进样量：10μL；柱温：30℃；梯度洗脱：0～3 min，流动相B：体积分数5%；3～10 min，流动相B：15%；10～12 min，流动相B：32.5%；12～13 min，流动相B：100%；13～15 min，流动相B：5%；15～22 min，流动相B：5%。

2）标准曲线的制作 分别取适量大豆异黄酮标准品和酱油渣样品用体积分数80%甲醇定容至10 mL，用0.45μm的膜过滤标准品溶液和样品溶液，进行HPLC分析，以峰面积（Y）为纵坐标，标准品质量浓度（X，mg/L）为横坐标，分别绘制标准曲线，得到大豆苷、大豆黄苷、染料木苷、大豆素、大豆黄素、染料木素6种异黄酮单体的标准曲线及回归方程。6种大豆异黄酮在质量浓度8～40 mg/L范围内均呈良好线性关系。

酱油渣中大豆异黄酮主要由染料木素、大豆素、黄豆黄素、染料木苷组成。作者以染料木素、大豆素、黄豆黄素、染料木苷4种大豆异黄酮单体的总和来表示酱油渣大豆异黄酮的总量。

1.3.4 大豆异黄酮提取条件优化 称取5 g酱油渣，液料体积质量比12 mL∶1 g，加入体积分数为70%的乙醇溶液，在70℃条件下提取4 h。选取乙醇体积分数、提取温度、提取时间、液料体积质量比为考察因素，其中，乙醇体积分数分别为50%、60%、70%、80%、90%、95%，提取温度分别为30、40、50、60、70、80℃，提取时间分别为1、2、3、4、5、6 h，液料体积质量比分别为4、6、8、10、12、14、16 mL/g。提取完成后，将提取液离心（3 500 r/min，10 min），取上清液定容，过0.45μm微孔滤膜后进行HPLC分析，计算酱油渣中大豆异黄酮的提取率，计算公式如下：

式中：Y为大豆异黄酮提取率（%）；C为定容后异黄酮提取液中总大豆异黄酮质量浓度（mg/L）；V为异黄酮提取液经离心、定容后的体积（L）；M为所用5 g酱油渣中大豆异黄酮总质量（mg）。

1.3.5 酱油渣中大豆异黄酮的纯化方法

1）醇沉法[24]（简称EP） 称取酱油渣100 g，按1.3.4的最佳提取条件得到大豆异黄酮粗提液，将所得到的异黄酮粗提液经旋转蒸发浓缩去除乙醇溶剂后冷冻干燥，得到异黄酮粗提物，取之加入1 000 mL的纯乙醇，4℃静置5 h后过滤，通过旋转蒸发，浓缩，将浓缩液冷冻干燥获得醇沉法大豆异黄酮纯化产物。

2）等电点沉淀法[25]（简称IS） 称取酱油渣100 g，按1.3.4的最佳提取条件得到大豆异黄酮粗提液，将粗取液pH调至4.5，置于4℃的冰箱中放置48 h后，3 500 r/min离心20 min，取上清液浓缩、冷冻干燥，得到大豆异黄酮纯化产物。

3）浓缩离心法[26]（简称CCF） 称取酱油渣100 g，按1.3.4的最佳提取条件得到大豆异黄酮粗提液，将粗提液至于浓缩至原体积的1/4，然后将浓缩液在4 000 r/min条件下离心，离心后快速倒出上清液，而沉淀中加入100 mL冷水，均匀搅拌混合20 min，再次离心，倒出水洗液，得到沉淀，将异黄酮沉淀冷冻干燥，得到浓缩离心法大豆异黄酮纯化产物。

4）溶剂萃取法[27]分别准确称取3份酱油渣100 g，按1.3.4的最佳提取条件得到大豆异黄酮粗提液，将粗取液浓缩回收乙醇，将浓缩液倒入锥形瓶中，分别加入等体积的乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷，500 r/min下搅拌0.5 h后，转移至分液漏斗中静止1 h，分液，萃取3次，合并3次萃取的有机溶剂相，对其进行真空浓缩，回收有机溶剂，并用适量的蒸馏水洗涤浓缩液，将浓缩液冷冻干燥，从而获得大豆异黄酮纯化产物。

5）浓缩离心法与二氯甲烷萃取法联用（简称CCF-DCM）：首先称取酱油渣100 g，按1.3.4的最佳提取条件得到大豆异黄酮粗提液，然后按照1.3.5.3中（2）的方法获得浓缩离心法大豆异黄酮产物，再将所得产物加入适量水使其分散于水中，用二氯甲烷萃取法进行处理，从而得到浓缩离心法与二氯甲烷萃取法联用大豆异黄酮纯化物（文中简称“异黄酮纯化物”）。

1.3.6 大豆异黄酮的纯度及回收率计算

式中：M1为经纯化后所得纯化产物总异黄酮质量，（mg）；M2为经纯化后所得纯化产物总质量，（mg）；C1为100 g酱油渣经提取后所得异黄酮粗提液中异黄酮质量浓度，（mg/L）；V1为100 g酱油渣经提取后所得异黄酮粗提液的总体积，（L）。

1.3.7 超氧阴离子清除能力的测定 采用邻苯三酚氧化法[28]测定。

1.3.8 DPPH自由基清除能力的测定 采用DPPH法[29]测定。

2 结果与讨论

2.1 酱油渣成分分析

对原料酱油渣中的水分、蛋白质、脂肪、灰分、总糖等各项指标进行了测定，酱油渣原料（干基）中含有质量分数0.35%的大豆异黄酮，而大豆中的质量分数在0.2%左右[26]，相比于大豆，酱油渣原料（干基）中大豆异黄酮的含量更高，这主要是因为大豆异黄酮难溶于水，因此在抽取酱油后，仍然有大量大豆异黄酮残留在酱油渣中。然而，酱油渣原料（干基）中还含有较多的杂质，其蛋白质质量分数高达32.57%，脂肪质量分数达8.48%，灰分及总糖质量分数达26.53%，此分析结果可为异黄酮提取纯化方法的选用提供依据。

2.2 酱油渣大豆异黄酮的提取

2.2.1 大豆异黄酮提取条件的优化 基于操作流程简单、提取率高、毒性小及容易回收溶剂等优点，作者采用乙醇提取酱油渣中大豆异黄酮。分别考察了乙醇体积分数、提取温度、提取时间、液料体积质量比对异黄酮提取率的影响，结果如图1所示。当乙醇体积分数大于90%时，提取率显著下降，而乙醇体积分数为70%的提取率与体积分数80%、90%的提取率没有显著性差异，见图1（a）；此变化趋势和沈春华等研究得到的结果相类似[21]。这可能是由于体积分数为70%、80%、90%乙醇溶液的极性与大豆异黄酮的极性更相近，依据相似相容的原理，有较多的大豆异黄酮溶于乙醇溶液中。当提取温度超过70℃时，大豆异黄酮的提取率显著下降，见图1（b）；出现此现象可能是由于温度过高，导致乙醇挥发和大豆异黄酮裂解，从而使得提取率下降。在4 h时提取率达到最大值，之后随着时间延长而显著下降，结果见图1（c）。这可能是由于提取时间过长、高温导致大豆异黄酮氧化、降解，因此提取时间不宜过长。液料体积质量比在4～12 mL/g范围内，提取率增加显著，料液体积质量比达到12 mL/g之后，大豆异黄酮提取率无明显改变，见图1（d）。这是因为在其他提取条件不变的情况下，相对大量的提取溶剂能够溶出更多的目标产物，当溶解达到平衡时，提取溶剂的量对大异黄酮的提取率影响不大，同时还会造成提取溶剂的浪费产生更多的成本。

综合考虑大豆异黄酮的提取率和提取成本，选取最佳提取条件为：乙醇体积分数70%、温度70℃、时间4 h、液料体积质量比12 mL/g，以此条件进行3次平行试验得到大豆异黄酮提取率为 （85.36±0.09）%，所得到的异黄酮粗提液经旋转蒸发浓缩去除乙醇溶剂后冷冻干燥，即可获得酱油渣大豆异黄酮粗提物（简称“异黄酮粗提物”）。

2.2.2 异黄酮粗提物基本成分分析 对异黄酮粗提物的基本成分进行测定，异黄酮粗提物中蛋白质、灰分、糖分的质量分数比较高，分别达到27.97%、42.75%、8.28%，而异黄酮质量分数只有1.21%，没有达到商品化异黄酮纯度的要求。因此，需对异黄酮粗提物进行除蛋白、灰分、总糖的处理，以提高大豆异黄酮的纯度。

2.3 酱油渣大豆异黄酮粗提物的纯化

据文献报道[24-27]，醇沉法、等电点沉淀法、浓缩离心法能有效去除豆粉异黄酮粗提物和酱油渣异黄酮粗提物中的蛋白质，而二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取法具有去除豆粕、酱油渣异黄酮粗提液中灰分、糖分的效果。因此，作者选用这6种方法对异黄酮粗提物进行纯化处理。

2.3.1 6种异黄酮纯化产物中的蛋白质、灰分、总糖质量分数的分析

图1 乙醇体积分数、提取温度、提取时间、液料体积质量比对异黄酮提取率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration，extraction temperature，extraction time and liquid-solid ratio on extraction rate of isoflavones

1）6种异黄酮纯化产物中蛋白质含量分析 比较了异黄酮粗提物和6种异黄酮纯化产物中蛋白质质量分数的变化情况，结果如图2（a）所示。与蛋白质质量分数27.97%的粗提物相比，浓缩离心法所得异黄酮产物中蛋白质质量分数下降到10.84%，蛋白质去除率达61.24%，在6种纯化方法中除蛋白质效果最好。这是由于异黄酮粗提液中的蛋白质主要以小分子蛋白质或肽类形式存在，而肽类的水溶性较好，大豆异黄酮水溶性较差，浓缩离心法水洗离心时可以沉淀大豆异黄酮，上清液可以溶解小分子蛋白质或多肽[30]。其他5种纯化方法所得异黄酮产物中蛋白质质量分数与粗提物相当，去除蛋白质效果差。因此，浓缩离心法可获得低蛋白质质量分数的异黄酮产物，合适用于去除蛋白质。

2）6种异黄酮纯化产物中灰分质量分数的分析比较了异黄酮粗提物和6种异黄酮纯化产物中灰分质量分数的变化情况，结果如图2（b）所示。在6种纯化方法中，二氯甲烷萃取法所得的异黄酮产物中灰分质量分数最低，灰分去除率达到87.23%，而醇沉法和等电点沉淀法所得异黄酮产物中灰分质量分数几乎没有变化。此外，浓缩离心法异黄酮产物中灰分质量分数下降到11.72%，仅次于二氯甲烷萃取法，结合图2（a）结果可知，浓缩离心法能同时去除蛋白质和灰分，可能因为在进行浓缩离心处理时粗提液的盐分也溶于上清液中，从而导致灰分质量分数下降。

3）6种异黄酮纯化产物中总糖质量分数的分析从图2（c）可知，6种纯化方法中浓缩离心法所得异黄酮产物中总糖质量分数最高，除糖效果最差。二氯甲烷萃取法所得异黄酮产物中总糖质量分数最低，仅有3.15%，总糖去除率达到61.91%，去除效果佳。此外，从图2（b）可知，二氯甲烷萃取法去除灰分效果相对也是最好的，这可能是由于二氯甲烷溶液与大豆异黄酮皆属于弱极性物质，依据相似相容的原理，大部分的大豆异黄酮能溶于二氯甲烷溶液中[31]，而灰分、糖分等杂质仍然保留在浓缩粗提液中。

图2 异黄酮粗提物和6种纯化产物中蛋白质、灰分、糖分的比较Fig.2 Comparison of protein content，ash content and sugar content in isoflavone crude extracts and 6 purified products

2.3.2 不同纯化方法所得大豆异黄酮纯化物的纯度及回收率分析 比较了酱油渣、异黄酮粗提物、6种不同纯化方法和CCF-DCM联用法所得异黄酮纯化产物中异黄酮纯度及回收率变化情况，结果如图3所示。酱油渣和异黄酮粗提物的纯度为0.35%和1.21%，与之相比，6种纯化方法所得异黄酮纯化产物中异黄酮纯度皆有不同程度提高，其中采用浓缩离心法所得纯化产物异黄酮的纯度达到7.75%，二氯甲烷萃取法所得异黄酮纯化产物中异黄酮纯度最高，为27.74%。因此，作者将浓缩离心法与二氯甲烷萃取法联用（CCF-DCM）对异黄酮粗提物进行纯化处理，联用后所得异黄酮纯化产物中的异黄酮纯度及回收率分别达到44.88%和53.36%，比异黄酮粗提物和酱油渣的异黄酮纯度分别提高37和128倍。CCF-DCM联用法所得纯化物中异黄酮纯度及回收率高于董玲燕等采用AB-8型树脂纯化所得的酱油渣异黄酮纯化产物中异黄酮纯度（41.98%）及回收率（41.84%）的报道[25]。

比较了异黄酮粗提物和CCF-DCM联用测定异黄酮纯化物中灰分、总糖、蛋白质质量分数变化，结果如图4所示。与异黄酮粗提物相比，经CCFDCM处理得到的异黄酮纯化产物中灰分、总糖、蛋白质质量分数分别从42.75%、8.27%、27.97%下降到0.88%、4.03%、4.99%，说明浓缩离心法与二氯甲烷萃取法联用后纯化效果更好，不仅操作简单，且所用二氯甲烷溶剂还能回收利用。

图3 异黄酮粗提物、异黄酮纯化物和6种异黄酮纯化产物中异黄酮纯度及回收率的比较Fig.3 Comparison of purity and recovery of isoflavones in isoflavone crude extracts，isoflavone purified products and 6 isoflavone purified products

图4 异黄酮粗提物与异黄酮纯化物中主要成分的比较Fig.4 Comparison of main components of isoflavone crude extract and isoflavone purified products

2.3.3 大豆异黄酮纯化物单体成分分析 酱油渣、异黄酮粗提物、CCF-DCM异黄酮纯化物的HPLC色谱图如图5所示。纯化后酱油渣、异黄酮粗提物的杂峰被有效去除，CCF-DCM异黄酮纯化物中异黄酮特征峰变化不大，且4种异黄酮单体（大豆素、大豆黄素、染料木素、染料木苷）均被得到很好保留，表明作者采用的乙醇提取、CCF-DCM联用分离纯化酱油渣中异黄酮的方法可行。

酱油渣中的异黄酮主要由大豆素（1.45 mg/g）、大豆黄素（0.20 mg/g）、染料木素（1.69 mg/g）、染料木苷（0.02 mg/g）组成；异黄酮粗提物中异黄酮单体大豆素、大豆黄素、染料木素、染料木苷质量分数分别为5.06、0.57、5.96、0.52 mg/g；CCF-DCM异黄酮纯化物中的异黄酮单体主要以糖苷配基型为主，大豆素、大豆黄素、染料木素质量分数分别为104.57、41.87、302.35 mg/g，均比纯化前显著提高，在总黄酮中所占比例分别为23.30%、9.33%、67.37%，其中染料木素所占比例较纯化前提高显著（P＜0.05），但未检测出染料木苷，这可能是由于纯化过程中糖苷型的染料木苷裂解为糖苷配基型的染料木素所致。

图5 酱油渣、异黄酮粗提物、CCF-DCM异黄酮纯化物的HPLC色谱图Fig.5 HPLC chromatogram of soy sauce residue，isoflavone crude extract and CCF-DCM isoflavone purified products

2.4 异黄酮粗提物和CCF-DCM异黄酮纯化物的抗氧化活性分析

异黄酮类化合物普遍存在于自然界植物体内，具有多种生理活性，而这些生理活性大都建立在异黄酮化合物具有较强抗氧化活性的基础上[32-33]。因此，以VC为对照品，作者考察了异黄酮粗提物和CCF-DCM异黄酮纯化物对超氧阴离子自由基、DPPH自由基的清除效果，结果如图7所示。

由图6（a）可知，随着异黄酮粗提物和异黄酮纯化物质量浓度的提高，超氧阴离子自由基的清除率逐渐提高，且清除率和浓度之间存在一定的量效关系。相同质量浓度下，异黄酮纯化物对超氧阴离子自由基的清除效果显著优于异黄酮粗提物，但与VC有一定差距，质量浓度为1 mg/mL时，VC、异黄酮纯化物、异黄酮粗提物对超氧阴离子自由基的清除率分别为99.83%、67.65%、16.75%（P＜0.05）。

由图6（b）可知，DPPH自由基清除率也随着粗提物和纯化物质量浓度的提高而提高。质量浓度为1 mg/mL时，VC、异黄酮纯化物、异黄酮粗提物对DPPH自由基的清除率分别为101.03%、89.18%、45.50%（P＜0.05），说明异黄酮纯化物对DPPH自由基的清除能力显著优于异黄酮粗提物，稍弱于VC。

图6 不同质量浓度样品对超氧阴离子自由基和DPPH自由基的清除率Fig.6 Scavenging rates of superoxide radicals and DPPH radicals by different mass concentration samples

同时，异黄酮纯化物超氧阴离子自由基、DPPH自由基清除能力的IC50值分别为0.34、0.26 mg/mL，显著低于异黄酮粗提物IC50值9.81、1.13 mg/mL（P＜0.05），说明异黄酮粗提物经CCF-DCM纯化后具有更强的抗氧化活性。异黄酮纯化物抗氧化活性的提高可能是基于纯化过程中糖苷配基型异黄酮（染料木素）得到有效浓缩，而糖苷配基型异黄酮比其相应的糖苷型异黄酮具有更高的生物活性[34]。

3 结语

选用乙醇提取法提取大豆异黄酮，最佳条件下获得的异黄酮粗提物中异黄酮质量分数为1.21%，经浓缩离心法与二氯甲烷萃取法联用纯化处理后，所得异黄酮纯化产物中蛋白质、灰分、总糖质量分数分别从纯化前的42.75%、8.27%、27.97%下降到0.88%、4.03%、4.99%，联用纯化方法不仅具有很好的纯化效果，且操作简单、成本低。所得异黄酮纯化物中异黄酮纯度达到44.88%，比酱油渣和异黄酮粗提物分别提高128倍和37倍，能满足商品化异黄酮产品对纯度的要求。此外，异黄酮纯化物中的异黄酮单体主要由大豆素、大豆黄素、染料木素组成，染料木素占比最高，为67.37%。抗氧化活性试验表明异黄酮纯化物对超氧阴离子自由基和DPPH自由基皆具较好的清除能力，其IC50分别为0.34、0.26 mg/mL，并且存在剂量效应关系，有望将其作为天然抗氧化剂进一步开发利用。本研究结果可为酱油渣异黄酮的开发利用提供一定的参考。