几种防褐剂对阿月浑子种胚培养褐化现象抑制效应研究

张 鑫

（天津创世生态景观建设股份有限公司，天津 300110）

阿月浑子（Pistacia veraL.）为漆树科黄连木属落叶小乔木，商品名俗称“开心果”，是世界著名四大干果之一，具有很高的经济价值。繁殖方法有播种、嫁接、根蘖分株、组织培养等[1]。其中组织培养方法不仅可以保持优良品种的遗传特性,也能有效提高其繁殖系数。在进行阿月浑子种胚组织培养过程中，严重的褐化现象抑制了组培苗的生长分化，甚至导致死亡。有多种因素导致阿月浑子种胚褐化现象的发生,其根本原因是阿月浑子组织中含有酚类物质,当酚类化合物含量高时,在合适的pH值、温度等条件下,酚氧化酶、酚类和氧气发生氧化反应,形成木质素、单宁和色素等有毒的醌类化合物[2-3],切口表面迅速变成褐色或棕色。这些醌类化合物扩散到培养基中,可以抑制其他酶的活性,毒害整个外植体,同时污染培养基,阻碍组织培养的进程。而在培养基中加入抗氧化剂(防褐剂)可以有效减轻褐化[4]。因此, 本试验研究了不同种类的抗氧化剂或吸附剂对阿月浑子组织培养褐化的抑制效应，旨在为抑制阿月浑子组织培养过程中的褐化现象提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验材料为邯郸阿月浑子栽培示范园内阿月浑子成熟果实。

1.2 试验方法

采集阿月浑子果实，于冰箱5 ℃冷藏24 h后，去掉外果皮在流水下冲洗30 min，在超净工作台上用75% 酒精浸泡2 min，再用20%次氯酸钠灭菌10 min，无菌水冲洗3～4次，置于无菌滤纸上吸去种子表面的水分，用已消毒的解剖刀和消毒镊子除去种皮，然后接种在培养基上,培养基为DKW＋2.0 mg·L-16-BA＋0.05 mg·L-1IBA，pH值为5.8。培养中加入一种浓度的抗氧化剂(防褐剂),每种抗氧化剂(防褐剂)选取3个浓度进行试验。共选取4种抗氧化剂(防褐剂)，分别是Na2S2O3、活性炭、Vc、PVP 4种抗褐剂。对照（对照组不添加任何防褐剂）和每处理接种5瓶，每瓶3个，3次重复，20 d后统计褐化率。

2 结果与分析

2.1 对照组阿月浑子褐化率

由表1可以看出，接种20 d的种胚褐化率在70%左右，外植体表面都覆盖了一层黑褐色物质,培养基也呈现出浅棕到黑褐色不同程度的变色，褐化现象很严重的，外植体趋于死亡，严重影响阿月浑子组培苗生长。

表1 对照组阿月浑子褐化率

2.2 不同浓度Na2S2O3对阿月浑子褐化率的影响

由表2可以看出，不同浓度的Na2S2O3对降低阿月浑子的褐化都能起到一定作用，其中以3.0 g·L-1效果最明显，较对照降低20%左右，1.0 g·L-1次之，5.0 g·L-1最差，随着褐化程度的降低，褐化率低的阿月浑子组培苗较对照生长速生增快，叶片颜色加深，数量增多。

表2 Na2S2O3对阿月浑子褐化率的影响

2.3 不同浓度活性炭对阿月浑子褐化率的影响

由表3可以看出，3个浓度活性炭的防褐化作用比较显著，不同浓度活性炭的抗褐化效果依次是 1.5 mg·L-1＞ 1.0 mg·L-1＞ 0.5 mg·L-1。与表2相比，阿月浑子组织培养褐化率的降低明显优于Na2S2O3。分析认为，活性炭之所以有极强的抗褐化能力，这可能与活性炭具有吸附醌类物质的作用有关，降低了阿月浑子外植体上醌类积累，从而降低褐化率。

表3 活性炭对阿月浑子褐化率的影响

2.4 不同浓度Vc对阿月浑子褐化率的影响

由表4可以看出，不同浓度Vc对降低阿月浑子褐化率都能起到一定作用，其中以3.0 g·L-1效果最明显，较对照降低20%左右，5.0 g·L-1次之，1.0 g·L-1最差。与表2、表3相比，3种抗褐剂防褐效果依次为：活性炭 ＞ Na2S2O3＞VC。

表4 Vc对阿月浑子褐化率的影响

2.5 不同浓度PVP对阿月浑子褐化率的影响

由表5可以看出，3个浓度PVP防褐效果均比较显著，与表2、表3、表4相比，抗褐化效果依次是：PVP ＞ 活性炭 ＞ Na2S2O3＞ Vc。不同浓度PVP抗褐化作用效果依次是： 1.0 mg·L-1＞2.0 mg·L-1＞ 3.0 mg·L-1。当浓度为 1.0 g·L-1时，效果最好，褐化率为33.3%，与对照相比褐化率降低了一半，其余2个浓度PVP抗褐效果也较好。随着PVP浓度的升高，抗褐效果降低。因此，PVP最适抑褐浓度为1.0 g·L-1左右。

表5 PVP对阿月浑子褐化率的影响

3 结 论

植物组织褐变现象是普遍存在的，且往往是多种因素综合作用造成的，给试验人员造成很大的困扰。如内因有接种材料的生理状态、品种、培植条件、营养状况、取材时间及外植体大小；外因则有培养基的浓度、盐度、糖度和激素的含量、温度、光照、通气状况等[5-6]。本试验以阿月浑子种胚为材料，研究了不同种类的抗氧化剂或吸附剂对阿月浑子种胚组织培养褐化的抑制效应。研究结果表明，4种防褐剂抗褐效果依次为：PVP＞ 活性炭 ＞ Na2S2O3＞Vc，其中 1.0 g·L-1PVP防褐效果最好，为33.3%，其次为2.0 g·L-1PVP和1.5 mg·L-1活性炭。所选防褐剂都是常用的抗氧化能力很强的物质，它们对阿月浑子的褐化抑制都有不同程度的作用，而且存在很大差异。这与防褐剂本身的理化性质有关，同时也受控于外植体材料种类和培养基的类型。防褐剂可能阻遏外植体切口处酚类物质的合成、分泌及氧化，而保持培养组织的生物活性。

[1]河北农业大学主编.果树栽培学各论（北方本）[M].

北京：农业出版社，1987：378-383.

[2]许新萍，卫剑文，范云六，等.用基因枪法转化籼稻胚性组织获得可育的转基因植株[J].植物学报，1999，26（3）：219-227.

[3]王国英，杜天兵，张宏，等. 用基因枪法将Bt毒蛋白基因转入玉米及转基因植物再生[J].中国科学（B辑），1995，25（1）：71-76.

[4]马贵民，徐光民.生物技术导论[M].北京：中国环境科学出版社，2006.

[5]马均，马明东，周宇爝.曼地亚红豆杉愈伤组织诱导试验[J].林业科学，2006，31（1）：12-14.

[6]李新凤，赵滢，田玉龙.植物组织培养中褐化问题的研究进展[J].吉林农业，2010（1）：66-67.