火焰兰茎段侧芽离体再生及褐化的研究

姚婧等

摘 要 以火焰兰的茎段为外植体，探讨不同植物激素配比对茎段侧芽萌发和生根壮苗的影响，以及不同培养基配方和不同添加剂对火焰兰生长过程中褐化现象的抑制作用。结果表明：最佳侧芽诱导培养基为MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.5mg/L，培养40 d，后诱导率可达97.95%；添加活性炭0.3 g/L可有效抑制侧芽诱导过程中的褐化现象，褐化率仅为13.17%；1/2 MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 1.0 mg/L+AC 0.5 g/L生根效果最好，生根率达到100%，且植株生长健壮。利用火焰兰茎段侧芽能够离体再生获得瓶苗，建立高效的火焰兰茎段为外植体的离体再生体系，为扩大拓宽火焰兰组织培养外植体来源和快速繁殖技术提供技术支撑。

关键词 火焰兰 ；离体再生 ；褐化 ；茎段侧芽

分类号 Q943.1；S682.31

Abstract The present study establishing efficient and stable Renanthera in vitro regeneration system by using stem buds， aim to expand the Renanthera explant sources and provide the technical support of rapid propagation technique of Renanthera. This research by using stem buds of Renanthera as explants， discusses the effect of different plant growth regulator combinations on the stem bud's inducing and rooting culture， and inhibitory effect of different medium and different additives on the growth process of Renanthera imschootiana Browning. Result：The optimal culture medium for stem bud inducement was MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.5mg/L， with the inductivity rate was 87.5% after 40 days of induction；adding activated carbon can control browning phenomenon of stem bud inducing culture effectively， with the browning rate was 13.17%； the optimal culture medium for rooting was 1/2MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 1.0mg/L+AC 0.5 g/L， with the rooting rate was 100%. Using the stem buds of Renanthera can in vitro regenerate plantlets， it's lay the foundation for the rapid propagation of Renanthera.

Keywords Renanthera coccinea Loureiro ； in vitro regeneration ； browning ； stem buds

火焰兰（Renanthera coccinea Loureiro）为兰科（Orchidaceae）火焰兰属（Renanthera Loureiro）的多年生附生或半附生草本，单轴茎，大型圆锥花序、着花多朵，多红色或橙黄色[1]，鲜亮艳丽，可广泛用于切花、盆花、立篱和园林布景等，具有极高的园艺应用价值及育种价值，自然分布于中国南部热带地区及东南亚地区。火焰兰传统的繁殖方式为切茎繁殖，繁殖系数较低，不利于产业化生产，应用组织培养进行繁殖可在短时间内获得大批种苗。目前已有利用火焰兰属的叶、茎尖、腋芽来诱导类原球茎的报道， Seeni和Latha[2]以云南火焰兰叶片及茎尖为外植体再生出试管苗；Laishram和Devi[3]以火焰兰的茎尖、腋芽和叶片为外植体，成功诱导出PLB；Wu等[4]利用火焰兰叶片进行了火焰兰的快速繁殖。陈之林等[5-6]分别以火焰兰、云南火焰兰、豹斑火焰兰等原生种的种荚进行无菌播种，获得火焰兰试管苗。目前，以火焰兰茎段为外植体进行组织培养的研究尚未见报道。因此，本研究以火焰兰茎段为外植体，旨在建立茎段离体再生培养体系，充实国内火焰兰离体培养技术，为火焰兰的快速繁殖提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料

火焰兰采自海南大学农学院教学实践基地海南野生兰花种质资源圃的火焰兰茎段。

1.2 方法

1.2.1 外植体消毒方法

将火焰兰茎段用自来水冲洗干净后剥去叶片，露出腋芽，切成约2 cm的带腋芽茎段，用0.1%的升汞溶液浸泡8 min，无菌水冲洗4～5遍。

1.2.2 侧芽的诱导

将消毒后的茎段接种于6-BA（1.0、3.0、5.0 mg/L）和NAA（0.2、0.5、1.0 mg/L）的9个处理组合的MS培养基中，分别统计接种25 d的侧芽诱导率和45 d的诱导率、褐化率和侧芽长度，公式如下：

侧芽诱导率=侧芽萌动数/接种外植体总数×100%；

褐化率=褐化外植体数/接种外植体总数×100%。

1.2.3 不同基本培养基对茎段褐化的影响

将茎段分别接种于MS、1/2 MS、MPR[3]、VW等4种培养基中，分别添加6-BA 3.0 mg/L，NAA 0.5 mg/L。接种25 d后观察生长情况，第40天统计诱导率、褐化率和生长状况。

1.2.4 不同添加剂对茎段褐化的影响

将茎段接种于对照、分别添加0.3 g/L活性炭（AC）或0.5 g/L抗坏血酸（VC）的MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L的基本培养基，接种25 d后观测生长情况，40 d统计诱导率、褐化率和生长状况。

1.2.5 继代增殖培养

将诱导出侧芽的茎段切去侧芽后接种于6-BA（1.0、3.0 mg/L）和NAA（0.2、0.5 mg/L）的4个处理组合，并添加了0.3 g/L活性炭MS培养基中，接种45 d分别统计增殖不定芽个数、增殖系数。

增殖系数=分化增殖的芽数/接种的芽数。

1.2.6 壮苗生根培养

将诱导出的1.5 cm长的侧芽接种于分别添加0.5 mg/L或1.0 mg/L NAA 激素的1/2 MS+6-BA 0.2 mg/L+AC 0.5 g/L培养基上进行壮苗生根培养，第25天统计叶片数、生根率、根数和株高。

生根率=（生根小苗数/接种的小苗总数）×100%。

以上试验每处理设3次重复，每处理接种20瓶，每瓶接种1个茎段；培养温度26～28℃，光照12 h/d，光照强度2 000 lx。

1.2.7 数据的统计与分析

采用SAS 9.2软件进行数据统计分析，其中，诱导率、褐化率和生根率经反正弦转换后进行方差分析，多重比较采用Duncan测验法。

2 结果与分析

2.1 不同激素配比对火焰兰侧芽诱导的影响

不同激素配比对火焰兰侧芽诱导的方差分析结果见表1。培养25 d后，每个处理都诱导出侧芽，其中处理5的诱导率显著高于其它处理，且侧芽生长较粗壮；但是培养45 d后，处理4、5和9之间的诱导率最高，都达95%以上且差异不显著，侧芽长度都达到1.2 cm以上，明显高于其它处理，处理5侧芽较其他两处理生长粗壮生命力旺盛；各处理褐化率均较高且处理9的褐化率显著高于处理4和处理5。综合考虑，处理5 （MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L）为侧芽诱导的最佳培养基，侧芽萌动早，诱导率高，侧芽长势好。试验发现，火焰兰茎段离体培养存在严重的褐化现象，不利侧芽的再生培养，因此，下面对褐化问题进行探讨和实验。

2.2 基本培养基对茎段褐化的影响

从表2可以看出，不同处理的侧芽诱导率都较高（95%以上），且差异不显著，说明不同基本培养基对火焰兰侧芽诱导率影响不大，但各处理的褐化率仍较高（大于80%）差异不显著。

从图1-A和1-B可见，接种25 d内MPR培养基较其他处理的褐化程度低，但在培养40 d之后各处理均严重褐化。可见低盐浓度的培养基仅在培养初期能减轻褐化，但无法彻底解决诱导过程中的褐化问题，因此考虑增加添加剂来解决褐化问题。

2.3 不同添加剂对茎段褐化的影响

以MS为基本培养基添加AC或VC的培养40 d状况（表3）可以看出，添加了添加剂的处理褐化率极显著低于对照，且AC的褐化率极显著低于VC，并且侧芽的长势良好，各处理诱导率均较高。

从图2-A，2-B可见，接种后25 d内VC和AC都能有效抑制褐化，但在培养40 d之后添加VC的培养基的褐化加重，添加AC的培养基褐化现象不明显。综上所述，添加AC诱导率高，且芽体长势最好，对褐化现象具有显著的抑制作用。

2.4 不同激素配比对火焰兰茎段不定芽增殖诱导的影响

通过不同激素配比对火焰兰茎段不定芽增殖诱导实验发现，各处理中诱导出不定芽的瓶数较少，为2～3瓶，每个茎段诱导出的不定芽数为3～5个，各处理部分茎段基部被褐化（图2-A）。统计方差分析结果（表4）可见，各处理间的增殖系数差异不显著，且均较低。说明通过直接诱导不定芽的增殖方式不太适合火焰兰。

2.5 不同浓度NAA对火焰兰壮苗生根的影响

从表5可见，1.0 mg/L NAA的生根率、株高均显著高于0.5 mg/L NAA的，且试管苗长势更健壮。各处理对诱导出的试管苗叶片数和根数差异不显著。因此，火焰兰最佳生根培养基为1/2 MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 1.0 mg/L+AC 0.5 g/L。

2.6 炼苗移栽

将长至2 cm以上瓶苗（图3-B）置于温棚中炼苗，1周后取出用自来水洗净附着的培养基后，放置于1 000倍多菌灵溶液中浸泡20 min，再用被自来水浸泡3 h的水苔包裹住苗根部，种植于5 cm×5 cm 小盆中（图3-E）。保持适宜湿度，置于阴凉通风处，进行正常水、肥、药管理。移栽炼苗20 d成活率高达98%以上。

3 结论与讨论

火焰兰为单轴茎兰花，植株上极少发育侧株，常规繁殖方式为切茎繁殖，繁殖系数低。组织培养技术是火焰兰快速繁殖的主要手段。以种子为外植体无菌播种获得实生苗不能良好地保持母本植株的品种特性，导致种苗质量参差不齐[7]。通过诱导原球茎之后获得再生植株，成苗速度较慢，多次继代后存在一定的变异率。前人研究表明，通过诱导顶芽或腋芽获得再生植株的扩繁技术发生体细胞变异的几率较低，是目前最稳定、最能保持优良性状的离体培养方式[8-10]，且繁殖时间短，出苗快。本研究以火焰兰侧芽茎段为外植体成功获得试管苗，成苗速度快，周期短，且不易发生变异。

兰科植物在离体培养过程中容易出现不同程度的褐化问题[11-12]。聂卫卓等[13]发现：降低无机盐的浓度和使用低盐培养基，较适合兰花的组织培养；AC能有效防止蝴蝶兰芽苗的褐化现象。陈瑶瑶等[15]发现，VC 对防止蝴蝶兰花梗腋芽诱导过程中外植体褐化的效果较好。本研究结果显示，使用低盐浓度MPR的培养基和添加VC仅在培养初期抑制茎段外植体的褐化，不能有效解决褐化问题，且需要频繁继代，工作量大。而添加AC可以有效减轻火焰兰褐化，对其侧芽诱导及生长有利。

兰花组织培养过程中增殖培养方法常采用茎段诱导不定芽或诱导原球茎。王丽丽等[16]采用古巴兰的茎段成功诱导出原球茎。本研究通过火焰兰茎段诱导产生不定芽进行增殖效果较差，可以尝试采用茎段侧芽诱导原球茎的方法进行火焰兰增殖诱导。

本研究以火焰兰茎段侧芽为外植体成功地诱导出了完整的植株，方法简单，加快了成苗速度；通过添加活性炭的方法有效地解决了茎段诱导过程中的褐化问题，以茎段为外植体的离体培养已成为最稳定有效的快繁方法。

参考文献

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