核酸适配体在海洋微生物 及海洋生物毒素识别鉴定中的应用研究进展

张庆庆,刘慧敏,吴仁协,鄢庆枇,曹 博,赵 铨,郑 江,*

(1.鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心,集美大学水产学院,福建厦门 361021;2.广东海洋大学水产学院,广东湛江 524088)

随着经济社会的发展和海产品养殖规模的扩张,我国越来越多地区的海产品中检测到海洋微生物和海洋生物毒素的存在[1-6]。海洋微生物和海洋生物毒素对海产品大范围的污染不但影响了海产品的质量,还使人们的生命健康受到威胁,同时也制约了海产品养殖业的健康发展。众所周知,海洋中存在数量众多的海洋微生物和一些具有特殊结构的海洋生物毒素。海洋微生物是海产品中的主要污染物之一,使海洋经济动物患病并造成巨大的经济损失,还残留在海产品中引起食用者不同程度的中毒反应,导致较大范围的公共卫生问题。而另外一种危害较大的污染物是海洋生物毒素,它主要由某些藻类和贝类产生,一般拥有较强的神经毒性,可致人死亡。由于赤潮的频发,使得这些毒素得以扩散并经由食物链进入鱼虾体内,造成多地多种海产品污染,最终危害人体健康[7]。因此,必须开展海洋微生物和海洋生物毒素的识别鉴定研究,这对维护海产品质量和食用安全具有积极意义。

近年来,针对海洋微生物和海洋生物毒素检测的研究不断深入并开发出一系列的检测技术,例如免疫诊断技术等。其中,核酸适配体是近些年来新兴的一种检测手段,它在海洋方面的应用才刚刚起步。核酸适配体是利用指数富集配体的系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment),即SELEX技术,从人工构建的寡核苷酸文库中筛选得到的一类对靶目标有高度亲和力和严格特异性的寡核苷酸分子。最早的核酸适配体是Robertson在1990年发现的对ATP具有高度亲和特异性的RNA片段[8],后来Tuerk等在此基础上建立了核酸适配体的体外筛选技术,并筛选出了T4噬菌体DNA聚合酶的适配体[9]。此后,核酸适配体在生物医学、药物筛选、分子检测等多个方面都得到了广泛的应用和发展,并与荧光标记技术[10]、放射性标记技术[11]、纳米技术[12]和微流体[13]等技术结合,在肿瘤细胞的检测、抗肿瘤药物的筛选以及靶向药物的研发方面,取得了较好的发展。

由于核酸适配体对靶目标具有较高的亲和特异性,使其在海洋微生物和生物毒素的识别鉴定中体现出较好的应用前景。本文主要从核酸适配体的应用角度,综述其在海洋微生物和海洋生物毒素中的应用研究进展,为核酸适配体的应用及海洋微生物和生物毒素的研究提供参考。

1 核酸适配体简述

核酸适配体的筛选是通过SELEX技术来实现的。SELEX技术筛选的基本原理是:首先体外合成一个单链随机寡核苷酸文库,将该文库与靶物质混合,形成靶物质-寡核苷酸复合物,然后洗去未与靶物质结合或结合较弱的寡核苷酸,剩余的则是与靶物质结合较强、亲和力较高的寡核苷酸分子,这些分子可通过加热变性等方法分离出,然后再以分离出的这些亲和力较高的寡核苷酸分子为模板进行PCR扩增,扩增出的寡核苷酸分子则作为新的寡核苷酸文库进入下一轮SELEX筛选。不断重复上述的筛选与扩增过程,使得一些与靶物质不结合或亲和力较低的寡核苷酸分子被逐渐淘汰,最终获得与靶目标有较高亲和力的寡核苷酸文库,即核酸适配体文库。随机寡核苷酸文库包括DNA文库和RNA文库,文库的中间通常为随机序列,两端则是固定序列,此固定序列是PCR反应及其他酶学反应相关引物的结合位点,可用于PCR反应或进行酶切作用。因此,核酸适配体的SELEX筛选的基本流程可归纳为如下几个步骤(如图1):靶物质与寡核苷酸文库结合,形成相应的复合物;洗脱;PCR扩增。经过多次重复的筛选、洗脱与扩增,与靶物质有高亲和力的寡核苷酸分子将在文库中得到富集,高亲和的核酸适配体的比例随SELEX筛选次数的增加而增加,最后达到筛选要求。

图1 SELEX技术流程图Fig.1 Flow diagram of SELEX technology

与抗体蛋白相比,核酸适配体具有多种优势。首先,核酸适配体更易于筛选、合成和修饰,在体外合成的同时,还可以修饰或连上一些功能基团或分子,如荧光素[14]、氨基[15]、纳米颗粒[16]和药物[17]等,而其功能和化学特性并不发生大的变化;其次,核酸适配体的特异性和亲和力比抗体蛋白更强更高,靶标物质的范围更广,而且核酸适配体无免疫原性,可以进入到细胞或肿瘤的内部,实现对病变部位的定位[18-19];另外,核酸适配体还能作为靶向运输的载体进行药物定向运输,而不会被当做外来抗原引起机体的免疫反应[20-23]。这些优势让核酸适配体在海洋微生物、生物毒素方面呈现出广阔的应用前景。

2 在海洋微生物中的应用

目前,针对细菌、病毒等海洋微生物的主要检测方法有生理生化方法、基于抗原抗体的免疫学方法和以核酸为靶分子的生物学检测方法等[24-26],而这些方法都存在各自的不足。例如,生理生化鉴定法虽然是经典的细菌鉴定方法,但是它耗时、测试项目较多,难以满足快速检测的要求;16S rDNA[27-28]等以核酸为靶目标的检测方法,对于同属细菌的检测区分效果并不理想,一方面是因为同属细菌的种间基因同源性很高,不容易区分,另一方面是由于检测扩增过程中,错配而引发的假阳性和非特异性结果时有发生[29],这些都严重干扰了检测的准确性;此外,以抗体为基础的免疫诊断技术,则由于严格的抗体制备条件、较长的制备时间、以及抗体的稳定性差、难以修饰等缺点,严重制约了其在微生物检测领域的应用。核酸适配体由于具有制备简单、特异性强、应用广等众多优点,在微生物和肿瘤细胞的检测方面呈现出较好的应用前景,但在海洋微生物方面的研究报道尚不多见,表1汇总了目前已筛选出的一些海洋微生物的核酸适配体及其功能参数。

表1 已报道海洋微生物核酸适配体汇总Table 1 Summary of reported marine microorganisms aptamers

注：-:文献中未报道。

2.1 在海洋病毒中的应用

随着海水养殖规模的不断扩大,越来越多的海洋经济动物被海洋病毒感染,给水产养殖业造成了巨大的损失,引起了人们对它的高度关注。核酸适配体在海洋病毒中的应用并不多,主要集中在虹彩病毒、神经坏死病毒等少数几个病毒。

虹彩病毒是一种20面体状、细胞质型DNA病毒,主要感染石斑鱼等许多重要的海洋和淡水经济鱼类,对中国和东南亚地区的水产养殖业带来巨大危害。Li[30]等利用Cell-SELEX技术筛选了被新加坡石斑鱼虹彩病毒感染的石斑鱼脾细胞的适配体,并以此为基础构建了一种基于适配体的酶联适配体吸附方法(ELASA)，用于被感染细胞的检测。该方法是将传统的酶联免疫吸附方法中的抗体替换为适配体,在细胞内外都能特异性地检测到虹彩病毒的感染,而且该方法只能识别被虹彩病毒感染的细胞,对被其他病毒感染或未感染的细胞没有亲和性,在检测的速度、稳定性和亲和特异性方面都超过了原有的酶联免疫吸附方法,全程检测时间仅需1～2 h。上述适配体不但对新加坡石斑鱼虹彩病毒感染的细胞具有很高的亲和特异性,而且研究发现它们还可以在细胞外抑制新加坡石斑鱼虹彩病毒对鱼细胞的感染,而对肝、脾细胞和宿主的其他组织等没有细胞毒性作用,并能被被感染的鱼细胞有效地内化,定位虹彩病毒在鱼细胞内的组装位点[31-32]。

此外,针对神经坏死病毒[33]、甲鱼虹彩病毒[34]、牙鲆弹状病毒[35]和病毒性出血性败血症病毒[36]的适配体也已被筛选出来,这些适配体不但对各自靶目标具有很好的亲和特异性,它们还能够显著抑制病毒对宿主的感染,而对宿主则没有细胞毒性作用。这些研究均表明：核酸适配体不但为海洋病毒的检测提供了新的方法和策略,还能对原有的相关技术进行提升并扩大其应用的范围,反映出核酸适配体在海洋病毒的检测中具有较好的应用前景,这也为研究海洋病毒致病机制、疾病治疗和药物研发提供新的思路。另外,由于适配体还能够进入被病毒感染的细胞,在靶向治疗方面也呈现出较好的应用前景。不过,目前获得的海洋病毒方面的适配体还较少,仍然需要大量的适配体筛选工作。

2.2 在海洋细菌中的应用

核酸适配体在海洋细菌中的应用研究主要集中于副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌等病原微生物。有研究表明,采用流式细胞仪、利用量子点修饰的适配体可以特异性地检测副溶血性弧菌,相应的亲和常数为16.88 nmol/L,并认为量子点的荧光寿命长、稳定性好,可以对标记的物体进行长时间的观察,比单独使用染料标记的探针灵敏度更高,能大大地增强其实用性和稳定性[37-38]。Duan[39]等开发出基于表面增强拉曼的适配体传感器,一个适配体固定在纳米颗粒表面用于捕获副溶血弧菌,另一个适配体则通过与副溶血弧菌的结合报告该弧菌的存在,该传感器在副溶血弧菌方面表现出很好的稳定性和亲和性,并在10～106CFU/mL范围内能实现对副溶血弧菌的定量检测,检测限为10 CFU/mL,这为其他相关研究奠定了较好的基础。一些研究则采用辣根过氧化物酶标记技术,对溶藻弧菌及其灭活菌的核酸适配体进行了筛选,获得了亲和常数为10～50 nmol/L的一系列核酸适配体[40],其对溶藻弧菌的检测限可达到10～103cells/mL[41-42],使得检测限更低并大大简化了检测过程,节省了时间。有关哈维氏弧菌的核酸适配体目前也已筛选出,其亲和常数在10～50 nmol/L的范围,并能在混合菌中较好的识别哈维氏弧菌[43],这为哈维氏弧菌的检测奠定了较好的基础。另外,有些适配体还能同时识别哈维氏弧菌和溶藻弧菌[44],其亲和常数在10～40 nmol/L的范围,该适配体对哈维氏弧菌和溶藻弧菌都表现出了较好的亲和特异性。此外,有关嗜水气单胞菌的核酸适配体也已筛选出来,但是关于该适配体的亲和常数和亲和特异性方面的研究尚未见进一步的报道[45]。综上所述,核酸适配体的出现为海洋细菌的检测研究开辟了新的思路,弥补了原有检测技术的一些缺陷,它与流式细胞仪、PCR等技术结合,使其灵敏度、稳定性和准确性都大为提高,反映出核酸适配体比抗体、基因等分子具有更好的应用性。

3 在海洋生物毒素中的应用

海洋生物毒素目前主要的检测方法有液相色谱法、基于细胞的传感器技术和酶联免疫检测技术等。虽然这些技术有着灵敏度高和可靠性好等优点,但是由于检测过程需要复杂的预处理、专业的操作和大量的时间,无法满足现场快速检测的需要[46]。核酸适配体则在这方面有一定优势,目前在海洋生物毒素方面的应用主要体现在河豚毒素、贝毒和藻类毒素等毒素的检测方面。

目前已筛选出了河豚毒素的核酸适配体,建立了相应的适配体-荧光染料检测方法,对河豚毒素的检出限可达到10-6mo1/L,并通过比较适配体不同区域对河豚毒素的不同亲和力,确定了相应适配体的核心识别区域[47-49],相关方法具有操作简便快速、成本低廉、灵敏度高等优点。在贝类毒素方面,Handy[50]等利用石房蛤毒素-蛋白结合物实现了对石房蛤毒素适配体的筛选,提供了一种针对低分子量毒素的筛选策略,增加了适配体对低分子量毒素的多样性和兼容性;Zheng[51]等在Handy等的基础上对原适配体进行了基因定点诱变和敲除等改造,得到了一个新的适配体,该新适配体对石房蛤毒素的亲和力更高,是原适配体亲和力的30倍,亲和常数达到133 nmol/L。在藻类毒素方面,目前已筛选出了双鞭甲藻神经毒素-2的核酸适配体,并利用该适配体开发出了相应的电化学传感器,其对双鞭甲藻神经毒素-2的检测限为106pg/mL,而对它的同系物双鞭甲藻神经毒素-3不发生交叉反应[52]。另外,膝钩藻毒素的核酸适配体目前也已筛选出来,该适配体能特异性地识别膝钩藻毒素,而对它的同源物不发生识别反应[53]。

核酸适配体作为一种新型的海洋生物毒素检测手段在灵敏度方面不如基于液相色谱的检测技术,但是核酸适配体较液相色谱等其他检测技术操作简单、快速、且成本更低,不需要对被测毒素进行复杂的预处理,更不需要昂贵的仪器和专业的操作,其灵敏度完全能满足日常检测的需求,实际应用可行性更高。但总的来说,目前核酸适配体在海洋生物毒素方面的研究报道还不多见。

4 前景

核酸适配体在海洋微生物和海洋生物毒素领域的研究虽然刚刚起步,但一些对靶目标具有较高亲和力和特异性的的核酸适配体已被筛选出来,一些基于核酸适配体的高灵敏的检测技术也已得到研究和应用,与传统的检测手段相比,基于核酸适配体的检测技术不但使过程简化,也大大提高了检测的灵敏度和准确性,在实用应用中体现了较好的开发前景。

当然,由于海洋环境中的微生物和毒素的种类众多、结构复杂,未来还有很多工作需要进一步开展。首先,还需要进行更大范围的筛选,要有更多的海洋微生物和生物毒素的核酸适配体被筛选出来,这是进一步研究开发的基础。其次,急需开展核酸适配体在定量检测中的应用研究。目前基于核酸适配体的应用检测基本还是以定性检测为主,由于海洋环境复杂,很难得到单一培养物,因此研发稳定、准确的基于核酸适配体的定量检测技术就显得极为必要。另外,利用核酸适配体对相应海洋微生物和生物毒素独有的亲和特异性,开发出一些能抑制靶目标生物活性的适配体药物或靶向载体[54-56],这对于核酸适配体的应用研发也将具有积极意义。

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