吸湿对不同干制方式下 枸杞粉活性成分及色泽变化的影响

赵宇慧,李世瑶,徐 昊,卜宁霞,刘敦华

(宁夏大学农学院,宁夏银川 750021)

粉体吸湿除了受外部环境因素包括温度、相对湿度影响之外,不同粉体的内部结构和化学成分差异也使得吸湿能力有所不同。近年来,国内外专家对粉体的吸湿性能开展了部分探究,发现不同干制方式对粉体的吸湿性能影响不同[1-4]。研究认为粉体吸湿主要是由于水分和粉末之间形成了液体桥[5]。影响其吸湿特性的原因主要有三个:其一是粉体表面粗糙,粉体间隙形成毛细管，吸附环境中水分;其二是粉体中易溶性成分与水分形成水合物;其三是粉体表面发生溶解,形成液体桥，产生粉体的黏连现象[6]。

枸杞有较高的营养和药用价值,其自身所含的多糖[7]、黄酮[8]、类胡萝卜素[9]和甜菜碱具有较高的抗氧化、抗衰老及免疫活性。枸杞加工主要以干制为主,而加工成枸杞粉后,可以用作辅料添加到面包、糕点等食品中,提高食品的营养价值和附加值。但在制粉过程中其所含挥发油、脂肪油、糖类等成分容易受热或返潮[10],在氧及酶的作用下易发生氧化、分解、聚合等反应而造成结块、霉变,严重影响枸杞粉内在质量,成为制约枸杞制粉工艺中的瓶颈问题。近年来,枸杞采后干制技术有了很大的进步,由传统的晒干逐渐转化为热风干制、太阳能干制、真空冷冻干制、微波干制等。由于每种干制方式的特点不同,因此制得的枸杞粉其性质也有所差别。刘光鹏[3]等对5种不同干燥方式所得枸杞微粉的营养成分和物理特性进行分析测定,发现真空冷冻干燥工艺生产枸杞微粉的品质最好,微波真空干燥次之。目前,对不同干制方式下吸湿前后枸杞粉活性成分研究尚未见报道。研究吸湿特性对不同干制方式下枸杞粉活性成分变化的影响对枸杞粉的贮藏加工有重要意义。

本实验采用分光光度法和高效液相色谱法测定三种不同干制方式下的枸杞粉在吸湿结块前后多糖、黄酮、类胡萝卜素三种活性物质的含量及其色度的变化,并对其吸湿结块过程中活性物质变化进行分析。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜枸杞 来自宁夏军马场;芦丁、咖啡酸、4-香豆素、阿魏酸、槲皮素 纯度≥98%,购自中国药品生物制品检定所;对香豆酸 纯度≥98%,购自成都曼斯特生物科技有限公司;甲醇、冰乙酸、正己烷、二氯甲烷、乙腈 均为色谱纯,购自天津市大茂化学试剂厂;EDTA、石油醚、无水乙醇、冰乙酸、丙酮 均为分析纯,购自天津市大茂化学试剂厂。

Easysep-1010高效液相色谱 上海通微分析技术有限公司;SP-120-5-C18反相色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm) 上海本昂科学仪器有限公司;RE-52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;TDL-5-A低速台式离心机 上海安亭科学仪器厂;KQ5200DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;CR-400/410色彩色差计 柯尼卡美能达公司;SHZ-D(Ⅲ)循环水真空泵 邦西仪器科技有限公司;DF数显集热式磁力搅拌器 常州爱华仪器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备

晒干:新鲜枸杞果实经5%食用碱进行脱蜡处理,均匀摊放于竹席,置于阴凉、通风处(以1 d为宜)。待枸杞失去部分水分后,移至通风、平整处曝晒，直至枸杞中水分含量为8%,得到晒干的枸杞干果,打粉过80目筛后备用。

烘干:新鲜枸杞果实经5%食用碱进行脱蜡处理,均匀摊放在托盘上置于45 ℃烘箱内,至枸杞中水分含量为8%,得到烘干的枸杞干果,打粉过80目筛后备用。

真空冷冻干燥:新鲜枸杞果实经5%食用碱进行脱蜡处理,于-80 ℃的超低温冰箱预冻24 h,均匀平铺托盘上,冷肼温度为-35～-40 ℃,真空度为0～10 Pa,加热板温度为10～40 ℃(加热板温度初始值为10 ℃,每隔1 h升温10 ℃直至40 ℃),至枸杞中水分含量为8%,得到冻干的枸杞干果,打粉过80目筛后备用。

1.2.2 样品的吸湿过程 三种不同干制方式的枸杞粉均置于环境温度为30 ℃(恒温培养箱),环境湿度为75%(NaCl饱和盐溶液)的条件下,同时吸湿30 d后测定各指标变化。

1.2.3 枸杞粉中活性成分含量的测定 参照GB 18672-2014方法,以葡萄糖为标准品,根据苯酚-硫酸法绘制出葡萄糖标准曲线y=10.89x+0.006,R2=0.998;枸杞总黄酮的含量测定参考文献[11]方法,绘制出芦丁标准曲线,y=0.0121x+0.0014,R2=0.9998;枸杞总类胡萝卜素含量测定参考文献[12]方法,在450 nm处测定吸光值。计算枸杞水提物中总类胡萝卜素含量(mg/g)。公式如下:

式中:A-吸光值;V-样液体积,mL;2480-在1 cm光程长的比色皿中1 g/L枸杞粉样品提取液的理论吸光值;m1-枸杞粉样品的质量,g。

1.2.4 枸杞黄酮类化合物的HPLC测定

1.2.4.1 黄酮类化合物标准曲线的绘制 精确称取标品芦丁2 mg、咖啡酸2 mg、阿魏酸1 mg、槲皮素1 mg、对香豆酸1 mg,用色谱级甲醇定容至10 mL容量瓶中,置于4 ℃冰箱内备用。HPLC条件参考文献[11]修改为:流动相A:甲醇,流动相B:0.4%冰乙酸;紫外波长290 nm,柱箱温度30 ℃,流速1.0 mL/min,梯度洗脱,洗脱程序:0～8 min,15% A;8～18 min,20% A;18～25 min,60% A;25～30 min,60% A;30～40 min,80% A;40～50 min,80% A;50～55 min,15% A。进样量20 μL,保留时间定性,以峰面积为纵坐标,质量浓度为横坐标采用外标法定量。

1.2.4.2 枸杞黄酮类化合物含量的测定 准确称取枸杞粉2 g置于烧杯中,加入100 mL的80%无水乙醇,70 ℃水浴浸提3次(2 h/次),抽滤合并滤液,55 ℃真空浓缩蒸干,加入适量石油醚振荡脱色2 min,浓缩蒸干残余溶剂,再用适量80%甲醇超声溶解,定容于10 mL容量瓶内,进样前经0.45 μm微孔滤膜过滤后,按照方法1.2.4.1进行测定。

1.2.5 枸杞主要类胡萝卜素化合物的HPLC测定

1.2.5.1 类胡萝卜素化合物标准曲线的测定 精确称取标准品β-胡萝卜素、叶黄素各1.0 mg,加入少量二氯甲烷溶解,用流动相定容至10 mL容量瓶内(避光操作),避光储藏于-25 ℃备用。按照文献[13]的方法进行修改确定液相色谱条件为:检测波长450 nm,柱箱温度25 ℃,流速1.0 mL/min,流动相:乙腈∶甲醇∶二氯甲烷∶正己烷=200∶75∶100∶100(v/v),等度洗脱,测定前经0.45 μm微孔滤膜过滤,进样量20 μL,保留时间定性,以峰面积外标法定量。

1.2.5.2 枸杞类胡萝卜素化合物含量的测定 提取方法参考文献[12],用流动相溶解后,经0.45 μm微孔滤膜过滤,按照方法1.2.5.1进行测定。

1.2.6 枸杞粉色泽的测定 采用色彩色差计测定法,以仪器白板色泽为标准,取吸湿前后三种干燥方式下的枸杞粉样品各10 g,依次平铺置于无色透明自封袋内,色差计校正后分别对样品的a*、b*、L*值进行测定。彩色指数a*和b*,a*值大小代表样品红色程度,值越大则样品色调越红;b*值大小代表样品黄蓝程度,值越大则样品的色调越蓝;明度指数L*,代表样品的明亮程度,值越大则样品色调越亮[14]。L*、a*、b*表色系还可以表示两种色调之间的差值,即色差,可用ΔE表示,它表示所测物体的L*、a*、b*值与白板之间的色差值。每批枸杞测定3次取平均值,根据ASTME308-99标准,计算公式如下[2]:

ΔL*=L*-L

Δa*=a*-a

Δb*=b*-b

式中:总色差ΔE表示相对于吸湿结块前的枸杞粉的L、a、b值作为标准参照。

1.3 数据分析

所有数据均平行测定3次,采用SPSS 20.0、Excel 2007进行数据处理与统计分析,采用Duncan多重比较法进行差异显著性分析,并用Origin 9.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 枸杞主要活性成分的含量

2.1.1 枸杞多糖含量的测定 枸杞中存在一些能与水分子中的极性基团结合的活性羟基,这些活性羟基是影响枸杞吸湿性能的主要因素之一[15]。由于多糖中的每个糖环都具有结合分子的能力,故多糖具有较好的水合作用,还具有控制水分移动的能力。枸杞粉的吸湿特性与多糖的存在密不可分,因此把吸湿前后多糖含量的变化作为衡量枸杞中活性成分的指标之一。

环境温度为30 ℃(恒温培养箱),环境湿度为75%时,不同干制方式下枸杞粉吸湿前后多糖含量变化如图1所示。可以看出吸湿结块过程对枸杞粉的多糖含量有显著影响(p<0.05),且不同的干制方式对枸杞粉多糖的含量也有显著影响(p<0.05)。由图1可知,相同干制方式下,吸湿前枸杞多糖含量均显著(p<0.05)高于吸湿后,吸湿过程会使枸杞粉中多糖含量降低。研究表明,常温下枸杞中的多糖含量随着放置时间的延长呈下降趋势[16]。这可能是因为枸杞粉在高温高湿环境下,不断吸收环境中的水分,粉体水分活度增加,诱导呼吸酶活性增加,呼吸作用增强,引起了多糖的消耗[17],从而导致多糖含量的降低。不同干制方式下,无论是吸湿前还是吸湿后,冻干枸杞多糖含量最高,烘干次之。从多糖含量降幅来看,降幅最小的干制方式为冻干,晒干次之。

图1 枸杞粉吸湿前后多糖含量Fig.1 The content of polysaccharides in Lycium barbarum powder before and after moisture absorption注:小写字母为不同干制方式下多糖含量的多重比较;大写字母为相同干燥方式下吸湿前后多糖含量的多重比较,同一指标肩上不同字母代表差异显著(p<0.05),图2、图3、表5同。

2.1.2 黄酮含量的测定 由图2可知,吸湿结块过程对枸杞粉的黄酮含量有显著影响(p<0.05)。相同干制方式下,吸湿后枸杞黄酮含量显著上升(p<0.05)。不同干制方式对枸杞粉黄酮含量影响显著(p<0.05),可以看出不同干制方式下枸杞粉黄酮含量大小为:烘干>晒干>冻干。相关研究表明,黄酮类化合物的合成与L-苯丙氨酸解氨酶(PAL)和肉桂酸-4-羟基化酶有关(C4H),而PAL和C4H的活性不仅与干制方法有关还受到干制条件影响[18]。晒干和烘干会使细胞迅速失水,失水应激会使枸杞更容易暴露在自由基和氧化环境中,从而增加枸杞的氧化应激,促使枸杞增加对抗氧化应激的相关基因表达,使PAL和C4H活性增加,从而刺激黄酮类化合物的合成[19]。

图2 枸杞粉吸湿前后黄酮含量Fig.2 The content of flavone in Lycium barbarum powder before and after moisture absorption

2.1.3 类胡萝卜素含量的测定 图3显示了三种干制方式下枸杞粉吸湿前后类胡萝卜素的变化。发现吸湿结块过程对枸杞粉的类胡萝卜素含量有显著影响(p<0.05),且不同的干制方式对枸杞粉类胡萝卜素含量也有显著影响(p<0.05)。总体来说冻干枸杞类胡萝卜素含量最高,达到2.380 mg/g,烘干次之。相较冻干,烘干和晒干的枸杞细胞失水更快,导致胡萝卜素快速降解以清除细胞失水产生的活性氧,维持细胞膜质稳定[20]。吸湿后类胡萝卜素含量表现为下降,这可能是因为储藏环境的温度[21]、湿度、光照作用促进类胡萝卜素的分解,从而导致了类胡萝卜素的降解。

表1 5种黄酮类物质标准曲线方程Table 1 The standard curve equation for 5 kinds of flavonoids

图3 枸杞粉吸湿前后类胡萝卜素含量Fig.3 The content of carotenoid in Lycium barbarum powder before and after moisture absorption

2.2 枸杞黄酮类化合物的HPLC分析

2.2.1 黄酮类化合物标准曲线的建立 配制好的标准品母液分别用色谱级甲醇稀释1、5、10、100倍,按照1.2.4.1中HPLC条件进样,重复测定3次,建立标准曲线,见表1。在对应的线性浓度范围内,5种黄酮类化合物标准品溶液浓度的相关系数R2都大于0.9995,其质量浓度与峰面积呈良好的线性关系,可以进行定量分析。

2.2.2 不同干制方式枸杞黄酮类化合物的分析 由图4可知,不同干制方式的枸杞粉吸湿前后黄酮类化合物各成分物质图谱共有峰较多且相似,说明吸湿前后枸杞的黄酮类化合物组成基本一致,黄酮总含量的差别主要体现在类化合物成分含量的多少。

表2 不同干制方式下枸杞黄酮类化合物的含量Table 2 The content of flavonoid from Lycium barbarum under different treatment methods

注:小写字母为不同干制方式下黄酮类化合物含量的多重比较,同一指标肩上不同字母代表差异显著(p<0.05);表4同。

表3 2种类胡萝卜素标准曲线方程Table 3 The standard curve equation for 2 kinds of carotenoids

由表2可知,不同干制方式下枸杞粉吸湿前后黄酮化合物含量均有所变化,其中阿魏酸、咖啡酸、对香豆酸含量减少,而槲皮素、芦丁含量增大。

与吸湿前相比,冻干、烘干、晒干枸杞粉吸湿后的阿魏酸含量分别减少了15.909、205.583、231.904 μg/g;咖啡酸分别减少了14.85、90.642、80.058 μg/g;对香豆酸减少了6.342、104.385、90.878 μg/g。吸湿前后枸杞粉中槲皮素、芦丁的含量变化与酸类相反,冻干、烘干、晒干枸杞粉吸湿后槲皮素含量分别增加了28.406、578.213、450.057 μg/g;芦丁含量分别增加了64.983、802.331、550.512 μg/g;说明水分增加激活了枸杞中类黄酮代谢途径中的黄烷酮羟基化酶的活性,使其酸类物质在该酶作用下进一步转化为槲皮素、黄酮类物质,使槲皮素、芦丁的含量增多,从而使得枸杞中总黄酮含量增加。

不同干制方式下黄酮类化合物的含量也有所差异,无论吸湿前后烘干和晒干枸杞粉的黄酮类化合物含量均大于冻干,这一结论与2.1.2检测结果相符。形成这一差异可能取决于干制过程的失水应激和氧化应激,晒干和烘干刺激了合成黄酮类化合物相关基因的表达[11],导致阿魏酸、咖啡酸、对香豆酸、槲皮素和芦丁含量比冻干枸杞粉中的多。

2.3 枸杞类胡萝卜素的HPLC分析

2.3.1 枸杞类胡萝卜素标准曲线的建立 将配制好的标准品母液分别用流动相稀释成0.1、0.05、0.01、0.025、0.005 mg/mL,按照1.2.5.1中HPLC条件进样,重复测定3次,建立标准曲线,见表3。由表3可知,在对应的线性浓度范围内,2种类胡萝卜素标准品溶液浓度的相关系数R2都大于0.9995,其质量浓度与峰面积呈良好的线性关系,可以进行定量分析。

图4 5种黄酮类物质标准混合溶液和枸杞样品的高效液相色谱图Fig.4 HPLC chromatograms of 5 flavonoids compounds standards and Lycium barbarum sample

2.3.2 不同处理方式枸杞类胡萝卜素HPLC的定性和定量分析 从图5可以看出,在实验选取的色谱条件下,枸杞类胡萝卜素各组分物质色谱峰与杂峰的分离度良好(均大于1.5),同时可以看出不同干制方式的枸杞粉吸湿前后枸杞类胡萝卜素各成分物质图谱共有峰较多且相似,说明吸湿前后枸杞类胡萝卜素物质组成基本一致,相似峰差别主要体现在类胡萝卜素成分含量的多少。

表4 不同处理方式下枸杞类胡萝卜素化合物的含量Table 4 The content of carotenoid from Lycium barbarum under different treatment methods

图5 2种类胡萝卜素物质标准混合溶液和枸杞粉样品的高效液相色谱图Fig.5 HPLC chromatograms of 2 carotenoids compounds standards and Lycium barbarum powder sample

由表4可知,三种不同方式处理的枸杞粉吸湿前后类胡萝卜素各化合物含量均减少,其中冻干处理下枸杞粉吸湿前后叶黄素、β-胡萝卜素分别减少0.269、0.977 mg/g;烘干处理下枸杞粉吸湿前后叶黄素、β-胡萝卜素分别减少0.212、1.124 mg/g;晒干处理下枸杞粉吸湿前后叶黄素、β-胡萝卜素分别减少0.138、0.629 mg/g。由于β-胡萝卜素见光不稳定、易氧化被分解,所以导致含量下降。在枸杞粉吸湿结块过程中,由于粉体长时间暴露在空气中,引起顺—反光异构化作用,造成类胡萝卜素分子的降解,导致含量下降[22]。

冻干、烘干、晒干下枸杞粉吸湿前的类胡萝卜素含量分别为2.380、2.016、1.288 mg/g,吸湿后含量分别为1.134、0.680、0.521 mg/g。根据类胡萝卜素不稳定性可知,引起类胡萝卜素降解的首要因素是氧,其次是光照,此外,高温会导致类胡萝卜素结构发生变化产生异构体[23-25]。冻干枸杞粉因其干制过程避光、低温、无氧,所以吸湿前后类胡萝卜素含量均最高。而烘干枸杞粉与晒干枸杞粉相比干制时与光接触较少,干制时间较短,所以烘干枸杞粉类胡萝卜素含量高于晒干枸杞粉的。

2.4 枸杞粉吸湿前后色度的测定

对吸湿前后热风干燥、真空冷冻干燥和晒干的枸杞粉进行色泽测定,结果如表5所示,其色泽参数L*、a*、b*均有显著变化;以吸湿前后的枸杞粉做对比,三种干制方式的枸杞粉吸湿后的L*、a*、b*值较吸湿前均显著降低,其中晒干枸杞粉降低了56.069%、39.815%、71.204%，冻干枸杞粉降低了50.229%、45.234%、67.063%，烘干枸杞粉降低了55.050%、36.936%、67.544%。由此可得在吸湿过程中b*值变化最大,色调逐渐变黄，且吸湿后的ΔE值均小于吸湿前的值。可能是由于水分的增加引起的,水分增加后枸杞粉的亮度自然下降,含水量增大后红色素被稀释,致使红色变浅,黄色程度加深[26]。

表5 不同处理方式下枸杞粉吸湿前后色度的变化Table 5 The change of chromaticity of Lycium barbarum powder before and after moisture absorption under different processing methods

不同干制方式的枸杞粉做对比,由ΔE值大小可知,吸湿前色泽差异表现为:烘干>晒干>冻干；吸湿后色泽差异表现为:冻干>烘干>晒干。相关研究表明,枸杞的色泽同其所含有的类胡萝卜素有很大的相关性[27]。类胡萝卜素对光、热和氧均具有较强的敏感性,真空冷冻干燥枸杞粉是在低温、真空、避光的条件下进行,避免了干燥过程中对类胡萝卜素的损害;而热风干燥过程中由于水分活度影响酶的活性,加上需要较长的时间,干燥温度较高,很容易发生酶的褐变、色素的分解[3],最终导致热风干燥制备的枸杞粉色泽较差,a*最小。吸湿后冻干枸杞粉色泽差异最大,可能是因为冻干过程中的低温抑制了酶的活性,常温下吸湿时酶的活性恢复，而晒干和烘干的温度破坏了酶,使酶彻底失活。

3 结论

吸湿结块对枸杞粉多糖、黄酮和类胡萝卜素含量影响均显著(p<0.05),吸湿后多糖和类胡萝卜素含量显著降低(p<0.05),黄酮含量显著升高(p<0.05),黄酮类化合物中阿魏酸、咖啡酸和对香豆酸含量减少而槲皮素、芦丁含量增大。

干制方式对枸杞粉中三种活性成分影响显著(p<0.05),冻干时枸杞粉多糖和类胡萝卜素含量均高于其他两种干制方式,而烘干时黄酮含量高于其他两种干制方式。干制方式影响枸杞中活性成分含量变化的原因可能是水分的变化导致酶活性的变化及其氧化应激反应,从而刺激相关基因的表达,而其具体影响过程还待进一步研究。

枸杞粉吸湿前后色度变化较为明显,L*、a*、b*值较吸湿前均显著降低。吸湿后的枸杞粉变暗、红色程度减少、色泽偏黄,色泽差异表现为:冻干>烘干>晒干。主要是因为枸杞粉的色泽与类胡萝卜素有很大关系,而类胡萝卜素较为不稳定,易受光、热和氧等因素的影响而降解。

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