pH控制策略及pH反馈流加培养法 提高罗氏产碱杆菌的聚羟基丁酸产量

邓志伟,王莹莹,张永杰,王松廷,杨生玉

(河南大学生命科学学院生物工程研究所,河南开封 475004)

伴随科技的进步和全球人口的持续增长,塑料被广泛用于日常生活及工业的各个方面。然而大部分的传统塑料,如Polyethylene、Polypropylene、Polystyrene等都是不可降解的塑料，它们的使用给环境造成了严重的污染。为了减少白色污染问题,可降解的生物塑料应运而生。PHB具备较好的生物可降解性及塑料热加工性,其分解产物能够被环境中的微生物彻底利用,对自然界没有任何污染。因此,PHB可以制成可降解垃圾袋、购物袋、一次性餐盒等,从而减少各种各样的废弃塑料对环境造成的严重污染。

聚羟基丁酸(PHB)是一种胞内存储的生物可降解材料,是微生物在培养基中碳源和氮源比例失衡的条件下而产生的,作为碳源和能源而储存于细胞内的物质[1]。PHB是微生物菌体同化作用的初级代谢产物,它可以维持渗透压的平衡,与动物细胞和植物细胞中的糖元及淀粉一样,是微生物内的储能物质[2-3]。在自然条件下细菌菌体内PHB含量比较低,一般为1%～3%。但在培养基中碳源含量过量并且氮源缺乏的情况下,细菌菌体内的PHB含量可以达到菌体生物量的70%～80%,因此通过控制发酵液中碳氮的比例来调节微生物菌体内PHB的产量,同时这也给分批流加一定的碳源来提高PHB的产量提供了理论基础。

国外关于PHB的探究起步较早,自20世纪70年代后,由于石油危机和环保运动,PHB的商业化生产受到许多科研工作者的重视。其中英国帝国化学公司是最早实现PHB工厂化生产的企业,其生产的PHBV(3-羟基丁酸酯和3-羟基戊酸酯的共聚物),命名为Biopol,此外,美国、日本、加拿大等国家也已经实现了PHB的小规模工业化生产[4-5]。Sathiyanarayanan等采用统计学方法优化BacillussubtilisMSBN 17菌株的发酵条件,发酵40 h后PHB含量达到19.08 g/L[6]。Moreno等分别采用摇瓶和生物反应器优化培养Bacillusmegaterium,其PHB含量分别增加48%和314%[7]。

尽管我国对PHB的研究起步较晚,但发展迅速[8]。魏国清等利用E.coli工程菌在5 L生物反应器中培养32 h,PHB浓度达到8.24 g/L,且PHB含量占细胞干重的84.6%[9]。但是胞内PHB的提取纯化工艺繁琐,造成它的成本大概为化学合成塑料的几倍,甚至十几倍,所以提高PHB的产量,减少生产成本成为国内外业界急需解决的难题。

采用分批补料培养的方法提高PHB的产量是近些年来研究的一个热点。分批补料培养是介于分批培养及连续培养之间的一种发酵培养技术。同分批补料发酵相比,分批补料培养[5]可以有效的降低底物浓度从而消除底物抑制、降低发酵液的粘度、增大体系初始溶氧浓度来提高底物利用率,从而缩短发酵时间,提高生产效率[10-11]。但是在已报道的研究工作中,PHB的生产得率一般低于0.25[12]。许懿等[13]利用真养产碱杆菌H16菌株生产PHB,细胞干重达到16.1 g/L,PHB的质量浓度达到7.9 g/L。本文首先研究了不控制pH及控制pH时发酵过程中相关参数的变化情况对发酵结果的影响,接着研究了pH作为补料的控制信号,采用pH反馈的发酵工艺来提高罗氏产碱杆菌的生物量和PHB的产量以及生产得率的方法。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

菌株Rochealcaligenessp PP25 由本实验实从污水中分离获得[14]；PHB标准品 色谱级,Sigma公司;甘油、(NH4)2SO4、MgSO4、Na2HPO4、NaH2PO4、K2HPO4、KH2PO4、FeSO4、柠檬酸、NaOH、HCl、浓H2SO4均为分析纯。

BIOTECH-5BG-7000A自动发酵罐 上海保兴生物设备工程有限公司;ZWY-2102恒温培养振荡器 上海智诚分析仪器制造有限;SW-CJ-2FD超净工作台 苏州净化设备有限公司;1515型高效液相色谱仪 美国Waters公司;5810R高速冷冻离心机 Eppendorf;GNP-9080隔水式恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司。

1.2 培养基

一级种子培养基(g/L):牛肉膏 30,蛋白胨 10,NaCl 5,琼脂 20,pH7.5。

二级种子培养基(g/L):葡萄糖 10,酵母粉 2,CaCl20.1,NaCl 1,K2HPO40.5,Na2HPO4·12H2O 0.6,pH7.0。

发酵培养基(g/L):葡萄糖 20,酵母粉 10,CaCl20.12,K2HPO42,Na2HPO4·12H2O 10,MgSO40.5,柠檬酸铁 0.1。

补料培养基(g/L):葡萄糖 400,酵母粉 100。

以上培养基在115 ℃下灭菌30 min。

1.3 培养方法

1.3.1 种子的培养 挑取斜面上的菌落接入一级种子培养基中,30 ℃、200 r/min培养24 h,然后吸取一级种子培养液以6%的接种量接入二级种子培养基中,30 ℃,200 r/min培养10 h,接着吸取二级种子培养液以6%的接种量接入发酵培养基中。

1.3.2 不控制pH分批培养 将培养10 h的二级种子培养液按6%的接种量接入5 L发酵罐(装液量3 L)中,400 r/min、30 ℃发酵培养24 h,pH不进行控制。研究在pH不控制的状态下的发酵过程。

1.3.3 控制不同pH的分批培养 不控制pH的分批发酵过程中,由于pH的降低,对菌体生长产生一定的抑制作用,因此在实验过程中利用6 mol/L的HCl和6 mol/L的NaOH调节发酵过程中的pH,使得pH分别控制在6.2～6.4、6.7～6.9、7.2～7.4三个范围,其他培养条件与1.3.2相同,考察了不同的pH范围对发酵结果的影响。

1.3.4 pH反馈的补料分批培养 pH反馈补料前期先进行分批培养,转速、温度同1.3.2,前期pH通过流加酸碱控制在6.8。pH反馈补料控制阶段,pH控制与补料关联的参数设置为反向关联,当pH>6.8时启动补料,补料模式为加2 s、停10 s。随着发酵过程中pH的降低,泵入6 mol/L的NaOH使发酵培养过程的pH保持在6.7～6.9范围内。

1.4 指标的测定

1.4.1 菌体生物量的测定 取发酵液10 mL,于离心机中8000 r/min离心10 min,弃上清,60 ℃干燥至恒重,称量[15]。

1.4.2 残糖的测定 发酵液中残糖的测定采用DNS法[16]。首先是标准曲线的绘制,分别取葡萄糖(mg/mL)0、0.2、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于25 mL比色管中,用蒸馏水补充至2 mL,加入DNS试剂1.5 mL,沸水浴加热5 min,冷却至室温,用蒸馏水定容至25 mL,混匀在540 nm波长下测定吸光度。将发酵液中的残糖进行稀释,糖浓度在0.1-1.2 mg/mL,取稀释后的发酵液1.0 mL于25 mL比色管中,加入DNS试剂1.5 mL,沸水加热5 min,冷却至室温后定容至25 mL,在540 nm波长下测定吸光度,从标准曲线查出葡萄糖浓度,求出发酵液中残糖的含量。DNS标准曲线方程为Y=0.3995X-0.0307,R2=0.9996,其中X为葡萄糖浓度(mg/mL),Y为吸光值。

1.4.3 PHB浓度的测定 PHB含量测定采用高效液相色谱法[17]。精确称量PHB样品200 mg,放到比色管中,用硫酸进行消化处理,以超纯水稀释1000倍,然后使用0.45 μm的微孔滤膜过滤备用,最后用高效液相色谱法进行检测。精确称量200 mg PHB的标准品,放到比色管中,加入5 mmol/L硫酸溶液进行处理,用超纯水分别稀释为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L的PHB溶液,注入液相色谱仪,记录色谱图,横坐标是PHB的浓度,纵坐标是峰面积。PHB的标准曲线方程为:Y=211096.5X-47170.5,R2=0.99946。X是PHB的浓度,mg/L,Y是峰面积。色谱柱:BioRad公司Aminex HPX-87H柱,(300 mm x 7.8 mm,9 μm);柱温:50 ℃;流动相:5 mmol/L硫酸溶液;初始流速:0.5 mL/min,进样量20 μL,紫外检测器波长210 nm。

1.5 数据处理

实验数据采用Origin 8.0进行作图和分析。

2 结果与讨论

2.1 分批培养

2.1.1 不控制pH的分批发酵过程 葡萄糖经糖酵解途径形成丙酮酸进而形成乙酰辅酶A,乙酰辅酶A在β-酮硫解酶、乙酰乙酰辅酶A、PHB合成酶等酶类的作用下合成PHB,因此在该过程下会受到pH的影响,所以在室验中我们首先研究了不控制pH时发酵过程的各种参数对PHB分批发酵结果的影响,结果见图1。从图1中我们可以看出随着发酵时间的增加,在发酵28 h时底物接近于消耗完全,PHB的浓度达到最高,PHB的浓度最大达到3.97 g/L。而此时发酵液的pH也从最初的7迅速降到了最低值,再随着发酵时间的增加,底物的消耗速率迅速下降,同时产物PHB的产量开始下降，说明不控制pH的条件下发酵液的pH迅速下降,并且相对酸性条件下不利于产物的产生和储存。在发酵24 h时菌体生物量达到最大6.55 g/L,然而随着pH的下降,菌体的干重并未发生太大的变化,说明发酵过程pH的波动对菌体的生长影响较小。然而pH的波动对产物PHB的产量具有一定的影响,而且随着碳源的耗尽,PHB也可以作为能源物质被利用,因此为了防止PHB在碳源耗尽时被菌体利用,选择pH上升点(发酵28 h)作为发酵终点,同时该点也可作为补料点,补充一定量的碳源和控制发酵过程的pH来防止产物PHB浓度的下降。

图1 在分批培养过程中相关参数的 时间曲线(pH不进行控制)Fig.1 Time course of correlation parameter during the batch culture (pH-uncontrolled batch culture)

2.1.2 控制pH的分批培养 PHB的生产过程是由酶一步步催化获得,不同的pH对酶的活性以及菌体的生长具有一定的影响,根据我们的实验室前期工作(数据未展示),选择了将pH控制在6.2～6.4、6.7～6.9、7.2～7.4三个范围来研究pH控制对PHB分批发酵结果的影响,结果见图2。由图2可得,与不控制pH的分批发酵相比,当pH控制在6.2～6.4时,菌体生物量及pH的产量分别提高了7.63%和3.63%;当pH控制在6.7～6.9时,菌体生物量及pH的产量分别提高了18.63%和12.52%;当pH控制在7.2～7.4时,菌体生物量及PHB浓度分别降低了24.76%和31.71%。由此图和以上数据可以看出当pH控制在6.7～6.9的范围时,不仅利于菌体自身的生长而且有利于PHB的合成,说明在pH为6.7～6.9的范围下有关菌体生长和PHB合成的酶处于较高的活性状态下,因此选择将发酵过程的pH控制在6.7～6.9。

图2 在分批培养过程中相关参数的时间曲线(pH进行控制)Fig.2 Time course of correlation parameter during the batch culture(pH-controlled batch culture)注:A：pH为6.2～6.4;B：pH为6.7～6.9;C：pH为7.2～7.4。

2.2 pH反馈补料分批培养

利用酸碱来调节pH的分批培养,可以使发酵过程中pH保持在一个相对较稳定的范围,从而使得菌体和产物的形成都优于pH不控制的分批发酵培养过程。但由于发酵培养(pH控制在6.7～6.9)进行到8～12 h之后,发酵培养基中的葡萄糖基本耗尽,进而在之后的发酵过程中菌体生物量的形成缓慢增加,同时产物PHB会被当成碳源利用,使得产物的产量下降。因此为了提高菌体生物量及PHB的产量,实验中选择在发酵8 h后进行补料,并同时对补料的流加方式进行了优化。

2.2.1 流加模式优化 在pH控制与补料相关联的补料分批培养过程中,通过反向关联的方式,以pH为信号来流加葡萄糖和酵母浸粉混合液,即当pH大于6.9时启动补料,反之停止补料。流加的碳氮混合液的量与控制模式有关。不同流加模式发酵过程的相关参数的影响结果见图3。

图3 pH反馈补料分批培养过程中相关参数的变化曲线Fig.3 Time course of correlation parameter during pH feedback fed batch culture

补料前的培养过程,通过流加酸碱使pH保持在6.7～6.9的范围内。图3A流加模式为加2 s，停10 s,补料分批培养过程中,在发酵开始阶段,发酵液的pH降低,蠕动泵自动加入2 mol/L的NaOH溶液使发酵过程中的pH维持在6.7～6.9,当葡萄糖消耗殆尽之后由于氨基酸的脱氨基作用使pH增加,当pH高于6.9时,补料泵自动加入葡萄糖和酵母浸粉混合溶液;图3B流加模式为加2 s、停20 s,pH控制范围为6.7～6.9的pH反馈补料分批培养过程。2种补料模式的分批补料培养过程的实验结果见表1。

表1 2种补料分批培养过程的实验结果Table 1 The experiment results in the two kinds of fed-batch culture

注:A、B表示不同的补料分批培养过程。

图3和表1的结果表明,pH反馈控制流加模式的变化对补料过程有明显的影响。图3、表1中的A流加模式,由于葡萄糖和酵母浸粉混合液的流加速度过快,导致发酵液中的葡萄糖质量浓度快速上升。过高的葡萄糖质量浓度抑制菌体的生长,最终延长了发酵的周期。B流加模式为葡萄糖的分解利用提供足够的时间,使发酵液的pH能够在6.87～6.92范围内波动,从而避免了因为补料过快造成的葡萄糖浓度快速增加,抑制菌体生长现象的发生,延长了菌体的对数生长期,提高了菌体生物量及PHB的产量。由图3可得,B流加模式发酵48 h即可使菌体生物量及PHB的产量达到最大，分别为22.14和14.41 g/L,而A流加模式发酵64 h才能使菌体生物量及PHB浓度达到最大,分别为19.69和13.717 g/L。与A流加模式相比，B的流加模式不仅可以缩短发酵时间,减少生产成本,同时菌体生物量及PHB浓度分别提高了12.44%和5.07%。

2.2.2 验证实验 按照上述优化后及优化前的流加模式进行重复实验,发酵48 h,共做3个平行,结果见图4。由图4可得,优化后的补料模式比优化前的补料模式的菌体生物量及PHB浓度分别提高了35.5%和31.94%。

图4 优化前后对比Fig.4 The comparison of before and after optimization

3 结论

本文利用罗氏产碱杆菌发酵生产PHB的过程中pH的变化情况,研究不同的pH范围以及不同的pH反馈调节补料的流加方式对发酵结果的影响。通过不控制pH及控制pH的分批发酵过程中的菌体生物量、PHB浓度及残糖的变化情况的研究得出,当pH不进行控制时发酵液的pH迅速下降到不利于菌体生产和产物产生的状态。同时控制pH在不同范围的研究表明，罗氏产碱杆菌在微酸性的条件下生长最快，且有利于PHB的合成。当pH控制在6.7～6.9时,菌体生物量及pH的产量比不控制pH时分别提高了18.63%和12.52%。

本文采用不同的pH反馈补料工艺,发酵生产PHB,最终得出最佳补料工艺参数为加2 s停20 s的模式,此时菌体生物量和PHB浓度分别为22.52 g/L和13.61 g/L，胞内的PHB含量达到60.44%。

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