铁皮石斛快繁体系多糖积累的研究

娄文娟,欧阳凡,董文宾

(1.河南科技学院食品学院,河南新乡 453003;2.陕西科技大学食品与生物工程学院,陕西西安 710021)

铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)为兰科石斛属多年生草本植物,大多分布在云贵、江浙一带。现有化学分析铁皮石斛复含多糖、生物碱及少量黄酮和酚类物质[1],大量药理学研究表明铁皮石斛具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖、提高免疫力等诸多功效[2-3],极具药用价值和保健特性。其中石斛多糖为铁皮石斛药用有效性和保健功能的主要体现物质[4-6]。

铁皮石斛自然条件下不易生长,且难以控制品质质量[7],现广泛运用的植物组织培养技术[1]确保了稳定且充足的铁皮石斛来源。在此基础上,铁皮石斛组培体系的质量标准急需确定并统一,因此组培过程中多糖积累的研究是获得稳定且高质的种苗的前提,由此尽可能获得多糖含量高的原料来源,实现功能保健性与经济利益的最大化。

目前铁皮石斛多糖积累的研究多局限在单一因素如激素[8]、基本培养基[9]、温湿度[10]等,对多因素的综合作用研究较浅。故本实验基于具有强生命活性的原球茎为载体,以多糖含量为筛选指标,研究了多种不同因素对铁皮石斛的多糖积累的影响,从而获得优化后多糖含量高的组培苗,以便进行后期进一步生产与加工。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

铁皮石斛种子 陕西秦脉兰业有限公司;硝酸钾 深圳南山有限公司，分析纯;硝酸铵 西安化学试剂厂，分析纯;蔗糖 天津盛奥化学试剂有限公司，分析纯;苄基腺嘌呤(BA) 上海蓝季科技发展有限公司，化学纯;激动素(KT) 上海山浦化工有限公司,化学纯;无水葡萄糖 天津市科密欧有限公司,分析纯;香蕉汁、椰汁 均为市售自配。

SC-3610型低速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司;DZ-1BC型真空干燥箱 上海艾测电子科技有限公司;旋转蒸发仪 西安安泰仪器科技有限公司;UV-2600型紫外可见光分光光度计 上海仪分科学仪器有限公司;电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司;高压灭菌锅 杭州亚旭生物科技有限公司;250B型光照培养箱 金坛市城东新瑞仪器厂;SW-CJ-1型单人净化工作台 苏州净化设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原球茎的获得 选取长势均一良好的铁皮石斛种子,在超净工作台上用氯化汞处理1 min和无水乙醇冲洗5～8次后,接种至MS+NAA 0.4 mg/L+BA 1.8 mg/L+椰汁100 g/L固体培养基放在光照培养箱中,培养温度为(20±2) ℃，湿度为60%，pH为5.5，保证光照10 h/d,光照强度(3000±20) lx,增殖继代3次,每20 d继代1次,选出长势均匀翠绿茁壮的原球茎。

1.2.2 原球茎的转接培养 选取长势均匀翠绿的原球茎,按照下述实验设计接种到不同配方的培养基中进行培养,培养条件与1.2.1保持一定,培养50 d后对原球茎进行多糖含量的测定。

1.2.3 多糖的测定 采用苯酚-硫酸法[11-12]。

1.2.4 Plackett-Burman设计 基于Minitab软件进行Plackett-Burman实验设计,所选的每个因素取高低两个水平,高水平一般为低水平的1.5～2.5倍。通过前期实验工作,本实验选出影响较大的7个因素,即氮源分子比、蔗糖、BA、KT、接种量、香蕉汁、椰汁。其他因素如NAA、温度、pH、光照时间和强度保持恒定,选用N=12的Plackett-Burman 设计表,另设3个虚拟变量,用于考察实验误差。各因素所代表参数、水平见表1。根据所得结果分析各因素对多糖含量Y水平的效应,并进行显著性(p<0.05)评价,从而获得对Y水平有显著影响的因素,筛选后的不显著因素在本实验不再考虑进行深入研究,之后进行的实验皆取最低水平。

表1 Plackett-Burman 实验因素水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design

注:硝态氮和铵态氮分子比是在氮浓度为60 mmol/L的情况下分子比的比值。

1.2.5 最陡爬坡实验设计 在得到显著因素后,使因素水平同时朝向响应值的最大方向变化,逼近最大响应区间找出峰值,才能建立有效响应面方程[13]。在本实验中,对多糖含量影响不明显的因素都选取最低水平,将得到的3个显著因素(硝态氮/铵态氮分子比、蔗糖、BA)根据响应值最大化的方向为爬坡方向,再依据3个显著因素各因素效应值与比例来确定变化步长,以便更快锁定最佳值区域。

1.2.6 Box-Behnken实验设计 根据 Box-Behnken的中心复合实验设计原理,结合之前得到的实验结果,基于Desgin-Expert软件进行Box-Behnken 实验设计。以多糖含量为考察指标,选取硝态氮/铵态氮分子比(A)、蔗糖(B)、BA(C)3个对颗粒质量影响较显著的因素为自变量,每个自变量的低、中、高实验水平分别以-1、0、1进行编码。每组重复三次,实验结果取均值,实验因素水平设计试验见表2。

表2 响应面试验因素水平Table 2 Factors and levels in RSA

注:硝态氮和铵态氮分子比是在氮浓度为60 mmol/L的情况下分子比的比值。

1.3 数据处理

本实验数据运用SPSS 23.0进行数据方差分析和显著性研究。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman实验筛选主效应因子

以铁皮石斛原球茎为实验材料,以多糖含量为响应值,对影响多糖含量的7个因素(硝态氮/铵态氮分子比、蔗糖、BA、KT、接种量、香蕉汁、椰汁)进行综合全面的筛选,并于3个空项(D、G、J)作误差分析,实验结果见表3,7个因素对考察指标影响的次序见图1和表4。

图1 影响因素标准化的帕拉图Fig.1 Pareto chart of influencing factor standardization

由图1和表4可知,因素B(蔗糖)、E(BA)、F(硝态氮/铵态氮分子比)效应显著,p值分别为0.031、0.045、0.048,可作为Box-Behnken进一步优化研究实验的因素。其他因素效应不显著,对响应值影响不大,出于显著性影响和经济成本的考虑,凡是影响不显著因素取低水平保持一致即可。

表3 Plackett-Burman 实验设计及结果(n=3)Table 3 Design and results of Plackett-Burman tests(n=3)

表4 回归系数显著性分析Table 4 Significance analysis of regression coefficient

注:p<0.01为极显著**,p<0.05为显著*。

2.2 最陡爬坡实验结果分析

对Plackett-Burman实验结果进行分析,可以看出因素B(蔗糖)、E(BA)、F(硝态氮/铵态氮分子比)对于原球茎多糖含量均有积极的促进作用。适当地增加因素B(蔗糖浓度)、E(BA浓度)、F(硝态氮/铵态氮分子比)的量,会使多糖含量升高。蔗糖为原球茎提供了能量来源和大分子物质[14]的合成材料,加速其新陈代谢,有效促进了石斛多糖的合成。而氮源的比例使原球茎朝着增殖或分化的方向发展[15],多糖的积累大多在分化阶段。当培养基中的硝态氮多过铵态氮,表现为石斛多糖含量的增加时,则说明硝态氮/铵态氮分子比越高会促进原球茎分化,从而积累更多的活性成分。细胞分裂素BA的加入可有效促进原球茎的生长活性[16],一定程度上会促进多糖的积累。

按照之前PB法得出的三个显著影响因素效应的大小确定最陡爬坡实验的爬坡方向和步长,尽可能来逼近最大响应值(多糖含量)的区域,实验设计与结果见表5。

由表5可以看出,在第4组实验中多糖含量最高,表明第4组实验的周围存在着最优点。则用实验4的条件为响应面实验因素水平的中心点,即蔗糖浓度、BA浓度、硝态氮/铵态氮分子比分别为30 g/L、1.6 mg/L、2∶1。

表5 最陡爬坡实验设计和结果Table 5 Design matrix and experimental results of steepest accent

2.3 Box-Behnken实验结果分析

对三个因素硝态氮/铵态氮分子比(A)、蔗糖浓度(B)、BA浓度(C)进行中心组合设计,并利用Design-Expert软件对15个实验点进行分析,如表6显示为实验设计及结果。实验9、14、15为区域的中心点,另外12个点为析因点。

表7 Box-Behnken实验方差分析结果Table 7 Analysis of variance of Box-Behnken experiment

注:p≤0.0001为高度显著,用**表示;p≤0.05为显著,用*表示;p>0.05为不显著。

表6 RSM实验设计和结果Table 6 Experimental design of RSM and corresponding results

实验结果经方差分析后所得模型的二次多项回归方程:Y=33.85-0.27A-1.12B+0.79C+1.34AB-1.17AC-0.70BC-4.29A2-4.04B2-2.20C2。

在本实验所选定的因素水平范围内,各因素对原球茎多糖含量的影响顺序为:蔗糖>BA>硝态氮/铵态氮分子比。根据回归方程作出的响应曲面图及其等高线图见图2～图4。图中能够较为清楚地表现出各因素及其两两之间的交互作用对响应值的影响。根据等高线的形状可以判断两因素间的交互效应对响应值的影响,圆形表现为不显著,而椭圆形体现着显著。

图2 氮源分子比和蔗糖对多糖含量交互影响的 响应面面图和等高线图Fig.2 Response surface and contour plots for effect of interaction between nitrate/ammonium molecule ratio and sucrose

图2显示了当BA浓度一定时,多糖含量随着氮源分子比和蔗糖添加量的增加而增加,且蔗糖添加量比氮源分子比对多糖含量影响更为明显,从等高线图可判断出这两个因素间存在明显的交互作用。如图3所示,当蔗糖添加量一定时,一定范围内多糖含量随着硝态氮/铵态氮分子比和BA浓度的增加而增加,且BA浓度相对于氮源分子比对多糖含量更显著,这两个因素之间存在着明显的交互作用。观察图4响应面图的响应趋势可知,多糖含量随着蔗糖和BA浓度的加大而增加,但到达中心区域后,多糖含量下降,并且蔗糖浓度相对BA浓度对多糖含量影响更为显著。由等高线图和方差分析表可知蔗糖添加量和BA浓度两个因素之间不存在交互作用。

图3 氮源分子比和BA对多糖含量交互影响的 响应面面图和等高线图Fig.3 Response surface and contour plots for effect of interaction between nitrate/ammonium molecule ratio and BA concentration

图4 蔗糖和BA对多糖含量交互影响的 响应曲面图和等高线图Fig.4 Response surface and contour plots for effect of interaction between sucrose and BA concentration

2.4 最佳培养条件的验证

通过Design-Expert软件根据二次多项回归方程求一阶偏导得出Y的极大值是在A=-0.09,B=-0.87,C=0.05,即硝态氮/铵态氮分子比、蔗糖、BA分别为1.91∶1,29.13 g/L,1.65 mg/L时原球茎的多糖含量最大为34.05%,相对于优化前实验(MS+BA 2.0 mg/L)得到的多糖含量25.36%已有显著提升。考虑到实际操作和实验设计的可行性,将上述最佳条件修正为硝态氮/铵态氮分子比为1.90∶1,蔗糖添加量为29.1 g/L,BA浓度为1.65 mg/L。在此条件下重复验证实验5次,测得培养的原球茎多糖平均含量为33.95%,与理论预测值34.05%的相对误差较小,这说明实验中的回归方程适合于原球茎多糖含量的预测和分析。

3 结论

本实验在铁皮石斛快繁体系中选择生长旺盛的原球茎阶段作为多糖积累的载体,运用Plackett-Burman设计从7种影响原球茎多糖含量的培养基成分中确定了硝态氮/铵态氮分子比、蔗糖和BA浓度为影响多糖含量最显著的影响因素。本着最快找出中心点的目的,设计了最陡爬坡实验并进一步进行Box-Behnken Design响应面方法分析,得出回归模型存在的最优结果为:当硝态氮/铵态氮分子比、蔗糖浓度、BA浓度分别为1.90∶1,29.1 g/L,1.65 mg/L时,多糖含量由优化前的25.36%提高到了33.95%,优化效果明显,在保证快速繁育的同时得到了较高质量的铁皮石斛苗。

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