基于碳纳米管富集净化作用 和电化学特性的真菌毒素检测方法研究进展

马 帅,王纪华,冯晓元,姜冬梅,韦迪哲,王 蒙

(北京农业质量标准与检测技术研究中心,农业部农产品质量安全 风险评估实验室(北京),农产品产地环境监测北京市重点实验室,北京 100097)

真菌毒素(mycotoxins)是产毒丝状真菌生长繁殖过程中产生有致病性和致死性的有毒次生代谢产物[1],主要污染谷物和油料作物[2]。据统计全世界每年约有25%的农产品被真菌毒素所污染,造成数百亿美元的经济损失[3]。真菌毒素具有性质稳定、熔点高、毒性强等特点,谷物产品一旦被污染,利用常规的加工技术很难去除,因此在谷物食品和饲料中就会产生毒素残留,对人畜健康造成严重威胁。快速、简便、高效测定谷物中的多种真菌毒素的方法,为谷物样品的高通量快速筛查提供可靠的技术支持,对于确保粮食及饲料安全,降低农业损失,降低真菌毒素对人类的影响和伤害,减轻粮食危机以及规避贸易壁垒具有重要的意义。本文根据真菌毒素的污染特点及碳纳米管的结构性能,对基于多壁碳纳米管的真菌毒素检测技术研究进行综述,并对真菌毒素检测技术发展的新趋势进行展望。

1 碳纳米管结构性能

碳纳米管(Carbon Nanotubes,CNTs),是1991年由日本纳米科学家饭岛澄男(Sumio Iijima)用高分辨透射显微镜观察电弧蒸发石墨产物时发现的一种具有独特物理化学性能的新型纳米材料[4]。碳纳米主要由呈六边形排列的碳原子构成的单层或数层同轴圆管组成,具有特殊的一维中空结构。按照其管壁碳原子构成的层数可分为:单壁碳纳米管(Single-Walled Carbon Nanotubes,SWCNTs)和多壁碳纳米管(Multi-Walled Carbon Nanotubes,MWCNTs)。SWCNTs是由单层石墨片卷曲形成的管状物,内径为1～2 nm,具有良好的对称性;MWCNTs则是由多层石墨片卷曲后形成的管状物,内径为2～20 nm,层间的距离约为0.34 nm,每层纳米管都是一个由碳原子通过sp2杂化与周围3个碳原子完全键合后形成的六边形平面而组成的圆柱面[5-6]。

碳纳米管由于其出色的性能和特殊的一维量子结构,使其在纳米电子器件、储氢材料、加工技术及生命科学[7-11]等众多领域表现出了潜在的价值和广泛的应用前景。研究发现[12-13],碳纳米管除了良好的化学稳定性之外,还具有许多超常特性:碳纳米管的管状和螺旋结构使其具有优异的电磁性能;碳纳米管有较大的长径比,使其具有较强的导热性能;纳米级的中空管状结构具有较轻质量密度、较大比表面积、较强氢键和π-π堆积作用等优点,使其对多种有机污染物具有很好的吸附性能。已有研究表明,碳纳米管作为吸附材料可以成功富集样品中的有机化合物[14-17]、金属离子[18]和有机气体[19],有效地提高了分析方法的灵敏度,而且具有可重复使用的性能。这些特性使其在农产品与食品质量安全检测方面有良好的应用前景。

2 真菌毒素的污染特点及检测技术研究进展

2.1 真菌毒素的污染特点

在已知的200多种真菌毒素中,黄曲霉毒素(aflatoxins,AFs)、赭曲霉毒素A(ochratoxin,OTA)、玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)、伏马菌素(fumonisin,FBs)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)和展青霉素(patulin,PAT)是常见危害较大的毒素[20],其中AFB1是目前发现毒性最强的毒素[21]。真菌毒素对农作物和食品的污染有如下特点:一是大多在μg/kg或ng/kg低水平级;二是毒素污染分布很不均匀;三是毒素种类多样,一种菌可产生多种毒素,同种毒素亦可由多种菌产生[22]。不同真菌毒素所侵染作物也有差异,AFs主要污染玉米和花生,同时毒素可通过食物链间接污染乳制品及肉类[23]。OTA在多种农作物中分布广泛且污染水平较高[24]。FBs主要污染玉米及其制品,ZEN多存在于大麦和燕麦等谷物[25]。DON主要污染小麦、大麦、玉米等谷类作物[26]。PAT主要存在于水果、蔬菜、面包和肉类制品之中[27]。

2.2 真菌毒素的危害及致病机理

真菌毒素可直接污染植物及其产品,也可通过被污染的饲料进入动物组织中,从而通过食物链的逐级传递对人类健康产生威胁。食品中几种常见真菌毒素的致病机理大致如下:AFs具有强致癌性和强免疫抑制性,抑制DNA、RNA的合成,破坏凝血机制及某些酶类[28];OTA对免疫系统和特异性肾有毒性,抑制ATP酶、琥珀酸脱氢酶以及细胞色素C氧化酶[29];ZEN具有雌性激素作用,对发育及生殖系统有很强的影响和破坏作用[30];FBs具有较强的肝脏和肾脏毒性;DON主要破坏细胞膜和酶类的功能,对造血系统和免疫系统有较强的毒作用;展青霉素是一种有毒内酯,具有潜在的致癌性和诱变性[31]。

2.3 真菌毒素的检测方法发展现状

目前,真菌毒素的检测方法主要生物鉴定法、化学分析法、免疫分析法和仪器分析法[32]。生物鉴定法特点是对待检样品纯度要求不高,主要作为真菌毒素的定性方法,但由于此方法专一性不强、灵敏度较低且实验周期较长,一般只作为化学分析法的佐证。化学分析法最常用的是薄层层析法,该法虽然经济实用,但定量效果、重复性和再现性较差。免疫分析法是利用抗原抗体反应原理来构建的一类较新的真菌毒素分析方法,主要包括酶联免疫吸附法、免疫荧光法和放射免疫法等，具有高灵敏度、高特异性、前处理简单和易于推广等优点[33-34],但该方法检测真菌毒素存在一定的假阳性,且抗体的制备时间长、成本高。仪器分析法是基于色谱质谱技术的检测方法,主要包括高效液相色谱法和液相色谱串联质谱法[35-37]，是目前真菌毒素检测的主要方法,高效快速分析能力为同时测定多种真菌毒素提供了条件,并通过与质谱技术联用提高分析的灵敏度和可靠性,但其对样品的前处理要求高,对操作人员技术要求高,且仪器设备价格昂贵。

3 基于碳纳米管的真菌毒素检测方法研究进展

3.1 基于碳纳米管结构特性的真菌毒素前处理方法

碳纳米管在样品前处理技术中的应用,按样品前处理方法大致可分成以下几类：

3.1.1 固相萃取法(Solid-phase extraction,SPE) SPE是基于固-液相色谱理论的样品前处理技术,基本原理是利用固体吸附剂提取溶液中的目标化合物或吸附杂质,实现目标化合物的净化和富集,SPE是目前微量、痕量检测中最常用的净化技术[38]。碳纳米管具有较大的比表面积、较强的氢键和π-π堆积作用等优点,使其在固相萃取真菌毒素、农药残留和重金属等方面有良好的应用前景。

Dong Mao feng等[39]采用MWCNTs为吸附剂的SPE技术与超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)法结合测定玉米、小麦和大米中的4种A型单端孢霉素(T-2毒素、HT-2毒素、新茄病雪腐镰刀菌烯醇和蛇形毒素),结果表明:MWCNTs的净化效果受pH影响很大,优化后采用正己烷提取、5%甲醇水溶液淋洗和1%甲酸甲醇洗脱可获得最佳提取效果,方法回收率为73.4%～113.7%,精密度为1.2%～17.1%,定量限为0.02～0.10 μg/kg,该方法对谷物中A型单端孢霉素的风险监测有重要作用。Brbara Socas-Rodríguez等[40]建立了以多壁碳纳米管作为SPE吸附剂的超高效液相色谱串联质谱法，测定水样和婴儿奶粉中由镰刀菌产生的6种真菌毒素(玉米赤霉烯酮、玉米赤霉酮、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉醇),研究者对多壁碳纳米管类型、多壁碳纳米管量以及洗脱液体积进行了优化。该方法在水样品和奶粉样品中的回收率分别为85%～120%和77%～115%,方法检出限分别为0.05～2.90 μg/L和2.02～31.9 μg/L,该方法具有简单、快速和环保的特点。已知的200多种真菌毒素中,仍有多种真菌毒素的检测方法未见报道,将碳纳米管优良的吸附特性与SPE技术相结合,可以开发多种真菌毒素联合测定的方法。

3.1.2 分散固相萃取法(Dispersive solid phase extraction,dSPE) dSPE是近年发展起来的样品前处理技术,该方法使用分散的萃取剂提取和净化样品中的目标物,由于其简便高效和溶剂用量少等优点而日趋普及。目前,最经典的分散固相萃取法是QuEChERs法[41],由于碳纳米管优良的吸附特性,可作为QuEChERs法中的吸附剂,用于真菌毒素的提取净化。

彭晓俊等[42]建立了QuEChERS-改性多壁碳纳米管提取净化结合液相色谱-质谱联用技术，同时，检测新会陈皮中6种真菌毒素的分析方法,并对提取溶剂和多壁碳纳米管用量进行了优化。在优化实验条件下,目标化合物在各自线性范围内均具有良好的线性关系,相关系数为0.9838～0.9982,检出限(S/N=3)为0.18～10 μg/kg。在低、中、高3个加标水平的平均回收率为72.4%～106%,相对标准偏差为2.2%～7.4%。该法准确、灵敏度高﹑操作简单快速,可应用于真菌毒素的快速筛查和确证。应永飞[43]采用多壁碳纳米管为吸附剂,建立了dSPE净化结合液相色谱-串联质谱，测定饲料中的6种玉米赤霉烯酮类霉菌毒素(玉米赤霉烯酮、玉米赤霉酮、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉醇)的方法。研究者对多壁碳纳米管提取时间、用量和类型以及洗脱液体积等条件进行了优化,方法回收率为94.6%～107.3%,检测限为0.12～0.27 μg/kg,该方法可以简便、快速和准确的测定饲料中的6种玉米赤霉烯酮类霉菌毒素。

3.1.3 磁固相萃取(Magnetic solid phase extraction M-SPE) 最近,磁性固相萃取得到了越来越多的关注[44-46],它利用磁性材料与吸附剂形成磁性吸附剂,可以由外部磁场通过一个简单的洗涤操作收集和回收,从而避免了传统SPE吸附材料存在固液分离困难的缺点,实现快速和简单的程序。磁性CNTs复合材料具有π-π 键相互作用、较大的比表面积及中空结构,可将其作为固相萃取吸附剂，用于富集与检测不同样品基质中的金属离子和有机化合物等。此外,CNTs表面修饰磁性纳米颗粒有助于复合材料吸附目标物后实现快速固液分离,为样品的前处理技术提供了新的思路与方向。目前,最常见CNTs与磁性氧化铁纳米颗粒的复合主要包括CNTs管内填充和表面包覆磁性纳米颗粒两类。前者是通过一定技术手段将磁性颗粒填充至CNTs的腔体内,常用的填充方法主要有化学气相沉积法和毛细管吸附法[47],包覆技术主要包括自组装法、溶剂热法和共沉淀法[48]。由于方便、简单、成本低和速度快等优点已被成功地用于测定生物分子、医药产品、环境和食品污染物[49-51]等。

Mao feng Dong等[52]采用化学共沉淀法制备了Fe3O4-MWCNT磁性纳米材料并进行了表征,建立了以Fe3O4-MWCNT为吸附剂UPLC-MS/MS联用的磁固相萃取法，测定薏苡仁中的4种A型单端孢霉素(T-2、HT-2、NEO和DAS),该方法对提取溶液、解吸溶剂和M-MWCNT用量几个关键参数进行了优化,方法定量限0.3～1.5 μg/kg,回收率73.6%～90.6%(R2>0.99),可简便快速测定薏苡仁中的4种真菌毒素。Zheng Han等[53]采用MWCNT-MNPs作为M-SPE吸附剂,与UPLC-MS/MS联用测定玉米中的6种玉米赤霉烯酮类霉菌毒素(玉米赤霉烯酮、玉米赤霉酮、α-玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇、β-玉米赤霉醇)。研究者通过对提取溶剂、解析溶剂、解析时间及MWCNT-MNPs用量进行优化,回收率达75.8%～104.1%,检测限为0.03～0.04 μg/kg,高效快速测定玉米样品中的玉米赤霉醇类毒素。

3.2 基于碳纳米管电学特性的真菌毒素检测方法

电化学免疫传感器,将特异性的免疫反应同具有高灵敏度的传感技术相结合,其中抗原和抗体为分子识别原件,与电化学传感原件直接接触并通过传感元件将浓度信号转化为相应的电信号的检测方法。在电化学免疫传感器的研制过程中,许多物质被用来放大传感器的信号,进而提高传感器的灵敏度,其中包括银纳米粒子(AgNPs)[54]、金纳米粒子(AuNPs)[55]、量子点和碳纳米管等材料[56-57]。由于其良好的韧性、稳定的化学性、较强的导电性和理想的比表面积等碳纳米管被广泛运用于电化学免疫传感器的研究。电化学免疫传感器法具有灵敏度高、选择性好、价格更低廉,并且可以现场快速检测等特点,已经被广泛运用于食品分析、生物医学、工业生产和环境检测等领域。

冯甜等[58]研制了一种基于单壁碳纳米管/壳聚糖(SWNTs/CS)复合纳米材料固定抗原的间接竞争电化学免疫传感器,可以灵敏检测AFB1。在优化的实验条件下,该方法的线性范围从0.01～100 ng/mL,检出限达到3.5 pg/mL。与传统的分析方法相比,所构建的免疫传感器具有更高的灵敏度,且更加简便。同时测定了玉米粉样品中 AFB1的含量,与传统的高效液相色谱法(HPLC)对照具有高度的一致性,相对误差在-4.4%～8.4%之间。张弦等[59]利用间接性免疫竞争的原理,利用游离OTA和赭曲霉毒素A-牛血清白蛋白(OTA-BSA)竞争结合定量的OTA单克隆抗体,研发了一种快速检测OTA的电化学免疫传感器。杨弦弦等[60]设计了SWNTs/CS电化学免疫传感器,可以高效灵敏地检测玉米样品中FB1,检测线性范围为0.01～1000 ng/mL,检出限可达2 pg/mL,此外,用该传感器检测添加FB1和自然污染的玉米样品,获得良好的回收率(96.34%～115.95%)。Li Shi chuan等[61]采用黄曲霉毒素氧化酶(AFO)嵌入在溶胶-凝胶法与多壁碳纳米管修饰的铂电极结合测定AFB1,方法线性范围为 1～225 ng/mL,检出限可达 1.6 nmol/mL。Liu Na等[62]研制了一种无标签的安培免疫传感器测定ZEN,以聚乙烯亚胺修饰的多壁碳纳米管修饰玻碳电极(GCE),用黄金和铂金纳米粒子(AuPtNPs)进行电沉积处理，可以增大抗体捕获能量提高电化学信号,方法的线性范围从0.005～50 ng/mL,检出限达到1.5 pg/mL。

表1 碳纳米管电化学特性在真菌毒素检测中的应用Table 1 Carbon nanotubes-based electric method for detection of mycotoxins

4 展望

近年来,随着对碳纳米材料的不断探索,其应用越来越广泛。碳纳米材料被应用于样品前处理方法研究,伴随其特性不断被开发和利用,可以给现有真菌毒素检测技术的发展带来更多新的方向,其可能的发展趋势和方向有以下几个方面:a.经过不同修饰的碳纳米管与QuEChERS或SPE相结合,用于多种真菌毒素的联合测定,随着前处理方法的不断更新,两者的结合必将成为未来分析研究的热点;b.磁固相萃取技术是21世纪分析领域中用于样品净化富集的革命性技术,与传统SPE技术相比可缩短平衡时间、提高前处理效率,免去过滤、离心等步骤,高度简化了样品前处理过程。将碳纳米管与磁固相萃取技术相结合应用于不同基质中多种真菌毒素的联合测定,是分析研究发展的方向之一;c.新材料特性及检测模式的开发,目前关于碳纳米构建电化学传感器用于真菌毒素检测已有不少报道,要继续提高检测灵敏度和检测速度,需从研发新材料和新结构方面入手;d.目前,前处理方法在真菌毒素检测中的应用将朝着开发多种检测方式和检测多种毒素的方向发展。

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