RT-PCR法检测卵巢癌中CD146表达及临床意义

卵巢癌的发病率居妇科恶性肿瘤的第三位，病死率居首位[1]。该病起病隐匿，缺乏有效准确的早期诊断方法，70%以上的卵巢癌患者发现时已为晚期[2]，失去了最好的治疗时机。因此积极探索卵巢癌的发病机制，对于其诊断及治疗具有重要意义。CD146属于细胞膜表面的跨膜糖蛋白，基因定位于人类11号染色体长臂，作为Ca2+非依赖性细胞粘附分子（CAM），主要参与细胞跨膜信号传导及促进内皮细胞的黏附与增殖[3]。CD146在妇科肿瘤中表达并与这些肿瘤的转移密切相关。但在对应的正常组织中低表达。本文研究通过RT-PCR技术检测CD146在卵巢癌中表达情况；并结合临床病理分期分析CD146在卵巢上皮性癌的表达意义。

1 标本来源

收集2015年1月—2017年1月在新疆医科大学附属肿瘤医院就诊患者30例正常卵巢组织标本和30例卵巢上皮性癌组织标本（其中，20例浆液性癌，5例囊腺癌，1例粘液性癌，4例透明细胞癌），两者在年龄、初潮年龄、孕次、产次对比，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性；入组卵巢上皮性癌患者术前均未进行放疗、化疗及生物免疫等治疗，经伦理委员会审核批准，保本获取前患者知情同意，所有标本均经病理科医师确诊。术中按国际妇科联盟（FIGO）推荐使用的标准进行手术分期。

2 实验方法

2.1 RNA提取

（1）用液氮研磨组织，取100 mg至1.5 ml离心中，加入1 ml Trizol，涡旋混匀，室温静置15 min；（2）加入200 L氯仿，颠倒混匀，室温静置5 min；（3）4 ℃，12 000 rpm离心15 min；（4）取上清至另一新的1.5 ml离心管，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，-20℃静置30 min；（5）4 ℃，12 000 rpm离心15 min，弃上清液；（6）加入1 ml 75%乙醇（75%乙醇用DEPC水配制）清洗RNA沉淀，混匀；（7）4℃，12 000 rpm 离心 3 min，弃上清保留沉淀，室温干燥2～3 min；（8）RNase-free H2O溶解RNA；（9）核酸蛋白定量仪检测RNA浓度、A260/A280，电泳检测RNA完整性。

2.2 反转录

（1）质检合格的RNA样本配制基因组去除体系：彻底混匀。简短离心，并置于42℃，孵育3 min。然后置于冰上放置。（2）配制反转录体。（3）将反转录反应中的Mix，加到DNA去除步骤的反应液中，充分混匀。（4）42℃，孵育15 min。（5）95℃，孵育3 min之后放于冰上，得到的cDNA可用于后续实验，或低温保存。

2.3 统计学方法

采用SPSS 17.0软件对数据进行分析处理，计量资料以（均数±标准差）表示，采用t检验；计数资料以（n，%）表示，采用χ2检验，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 实验结果

3.1 RNA提取结果

RNA样本A260/A280的比值是一种RNA纯度检测方法，比值范围为1.8～2.1，均合格。28S和18S核糖体RNA条带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），在加样孔位于图片上方的看图模式下，上面一条带（28S）的密度大约是下面一条带（18S）的2倍。下方还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA等）组成。在28S和18S 核糖体带之间一般可以看到一片弥散的染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。

3.2 RT-PCR实验结果

3.2.1 CD146 在卵巢上皮性癌组织上的表达高于正常卵巢上皮组织，差异具有统计学意义（P＜0.01），见表1。

表1 人正常组织与卵巢癌组织基因CD146表达量（±s）

表1 人正常组织与卵巢癌组织基因CD146表达量（±s）

正常卵巢组织标本 30 1.050±0.309卵巢上皮性癌组织标本 30 5.148±2.581 t值 - -8.634 P值 - 0.000

3.2.2 CD146在卵巢上皮性癌组织中的表达与临床分期的关系CD146在卵巢上皮性癌组织中的表达强度与病理分期有关（P＜0.05），肿瘤组织分化越差，分期越晚CD146表达越高，见表2。

表2 卵巢上皮性癌CD146的表达与部分临床病理特征的关系

4 讨论

肿瘤的基本特征是失控性生长，其发生、发展是一个多因素、多步骤的复杂过程，包括癌基因的激活或抑癌基因的失活以及某些信号通路的激活或失活；肿瘤的生长和扩散转移与其微血管生成和数量增加关系密切，无论是原发肿瘤还是转移肿瘤在生长扩散过程中都依赖血管生成[4]。血管内皮细胞的黏附、增殖和迁移是血管新生的关键过程，细胞间黏附分子在这一过程中发挥重要作用。CDl46作为黏附分子在细胞与细胞、细胞与细胞外基质间发挥重要的黏附作用。不仅介导形成肿瘤细胞簇而促进肿瘤细胞间相互作用，也通过诱导肿瘤血管新生而促进肿瘤生长和扩散转移，并在细胞骨架重组、跨膜信号传导、细胞运动及迁徙等方面发挥重要作用。CDl46参与新血管的生成，从而为肿瘤的生长和转移提供必要的营养。CDl46调节肿瘤血管形成的机制可能通过激活基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2），MMP2降解细胞外基质，血管内皮生长因子被激活后促进血管生成和肿瘤转移。导致肿瘤转移和肿瘤血管形成[5]。并且发现CDl46阳性的肿瘤血管内皮细胞与肿瘤细胞上的CD146配体结合，引起肿瘤细胞聚集堵塞血管，继而黏附于血管内皮，使肿瘤细胞向周围组织浸润、转移[6]。研究表明，CD146 在多种恶性肿瘤组织中高表达，与肿瘤进展关系密切。前列腺癌的研究中，检测前列腺癌和前列腺增生组织中的CD146蛋白表达，结果发现CD146可能参与了前列腺癌的发生发展过程。淋巴瘤的研究中，建立肿瘤淋巴道转移模型并引用高通量基因芯片技术比较淋巴道转移能力高、低不同的小鼠肝癌细胞系淋巴道高转移（Hca-F）和淋巴道低转移（Hca-P）的基因表达谱，筛选肿瘤淋巴道转移相关基因，发现淋巴道转移的Hca-F细胞株中CD146呈高表达。对黑色素细胞瘤研究发现，将异位表达CD146的SB-2细胞系通过尾静脉注射入裸鼠体内，其肺转移能力增加了[7]。反之，有报道将A375M 和C8161细胞系的CD146表达沉默或用其抗体抑制后，此两细胞系在裸鼠中的远处转移能力显著减弱，进一步说明CD146与肿瘤的转移有关。本研究显示，CD146 在卵巢上皮性癌组织中的阳性率高于正常组织，差异有统计学意义（P＜0.05），提示CD146在卵巢上皮性癌的发生、发展中起重要作用。

Chen在子宫内膜癌中的研究发现CD146的高表达与不良预后密切相关[8]。乳腺癌研究中，CD146的强表达增强了乳腺癌细胞的侵袭能力，并与患者预后呈正相关。本研究结果显示，随着组织学分化程度的降低、临床分期的升高，CD146的表达强度升高，提示CD146 与卵巢上皮性癌发展、转移有关。由于本研究组未进行随访，故无法对CD146 的表达与患者预后关系进行分析，但手术分期是影响预后的重要因素，本研究结果提示CD146 对判断预后有一定的参考价值。

CD146高表达与卵巢上皮性癌的发生、发展及转移有一定的关系，有可能成为卵巢癌预后及复发的特异性标记物，为卵巢癌的分子靶向治疗提供理论依据，为进一步分子水平的研究奠定实验基础。

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