二氯乙酸对膀胱癌细胞株T24克隆形成、侵袭和迁移的影响

谢智彬 付伟金 陆春宇 赵东 徐艳圳 吴华裕

广西医科大学第一附属医院（南宁 530021）；广西医科大学（南宁 530021）

膀胱癌是泌尿系肿瘤中常见的恶性肿瘤［1］，具有易复发、侵袭转移等特点，因此大部分患者确诊时已达中晚期，所以抑制肿瘤复发和转移对患者的生存预后及生存质量有重要意义。上皮间质转化（epithelial⁃mesenchymal transition，EMT）是指细胞失去上皮细胞特性和极性，重构细胞骨架网，使其获得间皮细胞特性和运动能力，从而促进肿瘤细胞的侵袭转移能力［2］。因此，抑制EMT是当前抗膀胱癌的侵袭迁移研究的热点。二氯乙酸（dichloroacetate，DCA），也称二氯醋酸，是一种小分子代谢调节剂，临床上主要用于治疗乳酸中毒和线粒体遗传性疾病［3］。近年来研究发现DCA在多种肿瘤细胞中具有明显抗肿瘤活性，如肾癌、结肠癌、子宫癌等［4-6］，但DCA作用于膀胱癌T24细胞的克隆形成、侵袭及迁移的影响在国内外却鲜有报道。因此，2016年4-12月笔者观察了DCA对膀胱癌T24细胞克隆形成、侵袭、迁移能力及对EMT相关蛋白表达的影响，并初步探讨其相关机制，为逆转膀胱癌转移提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料 细胞：人T24细胞株购自中国科学院细胞库。药物：二氯乙酸（Sigma）试剂：胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（gibco）、双抗（gibco）、胰酶（gibco）、1640培养基（gibco）、Giemsa染液（Sigma）、二甲基亚砜（DMSO）（Sigma）、PBS（Sig⁃ma）、Matrigel基质胶（Corning）、RIPA细胞裂解液（Sigma）、BCA试剂盒（碧云天）、逆转录试剂盒（Takara）、GAPDH引物、钙黏蛋白E（E⁃cadherin）引物、钙黏蛋白 N（N⁃cadherin）引物、波形蛋白（vimentin）引物Snail引物及Slug引物均由金开瑞生物工程有限公司合成。兔抗人β⁃肌动蛋白（β⁃actin）/E⁃cadherin/N⁃cadherin/vimentin/Snail/Slug 抗体（Abcam）。仪器：Transwell小室（Sigma）、各种规格培养瓶（皿）、离心管（Corning）、CKX41倒置显微镜（Olympus），37℃ 5%CO2恒温孵育箱（Thermo）。

1.2 细胞培养 细胞用含有10%FBS和1%双抗的1640培养基于5%CO2、37℃恒温培养箱内常规培养。取生长对数期细胞用于实验。

1.3 细胞克隆检测 取对数生长期的T24细胞以500个/孔均匀接种于6孔板，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞贴壁后，实验组加入含5、10、20 mmol/L DCA的无血清培养基2 mL，对照组加入等量含0.1%DMSO的无血清培养基培养，当肉眼可见克隆形成时，终止培养；弃去培养基，用PBS洗3次，用甲醇进行固定20 min，Giemsa染液染色30 min，冲洗后空气干燥；拍照、计数肉眼可见的克隆数目。实验重复3次。

1.4 细胞划痕检测细胞迁移能力 将T24细胞接种于6孔板培养，待细胞生长面积达90%后，用10 μL加样枪头对细胞进行划痕损伤，每孔划痕1次。用PBS洗3次，将脱落细胞和细胞碎片冲洗干净。实验分组及处理同1.3继续培养，于0、24、48、72 h倒置相差显微镜下观察拍照（×100），根据细胞间距计算迁移率，细胞迁移率=（1-愈合后间距/起始间距）×100%。实验重复3次。

1.5 Transwell小室检测细胞侵袭能力 将T24细胞以1× 105/mL密度，200 μL接种于铺有Matrigel基质胶的Transwell小室上室，实验分组及处理同1.3，下室加入600 μL含20%FBS的RPMI1640培养基，37℃、5%CO2条件下培养24 h后，用棉签轻轻擦去基质胶和上室未穿膜细胞，甲醇固定10 min，0.1%的Giemsa染液室温下染色30 min，镜下随机5个视野（×100）观察结果并拍照、计数，取均值。实验重复3次。

1.6 Real time PCR 法检测 E⁃cadherin、N⁃cad⁃herin、vimentin、Snail及Slug mRNA的表达 取T24细胞接种于6孔板培养，待细胞处于对数生长期时，实验分组及处理同1.3继续培养48 h，TRIzol法提取各组细胞的总RNA，用紫外分光光度计检测RNA的纯度和浓度；取1 μg总RNA，应用反转录试剂盒将其反转录成cDNA，反转录条件37℃15 min、85 ℃ 5 s，以cDNA为模板应用Real time PCR检测各组细胞中E⁃cadherin、N⁃cadherin、vimentin、Snail及Slug mRNA的表达。N⁃cadherin基因上游引物序列为 5′⁃GCCACCTACAAAGGCAGAAG⁃3′，下游引物序列为 5′⁃ACTGTCCCATTCCAAACCTG⁃3′；E⁃cadherin基因上游引物序列为5′⁃TCATGAGT⁃GTCCCCCGGTAT⁃3′，下游引物序列为 5′⁃TCTT⁃GAAGCGATTGCCCCAT⁃3′；vimentin基因上游引物序列为 5′⁃GGACCAGCTAACCAACGACA⁃3′，下游引物序列为 5′⁃AAGGTCAAGACGTGCCAGAG⁃3′；Snail基因上游引物序列为 5′⁃CTGGGTGCCCTCAA⁃GATGCA⁃3′，下游引物序列为 5′⁃CCGGACATG⁃GCCTTGTAGCA⁃3′；Slug基因上游引物序列为5′⁃ATCTGACCCGTCGTGACG⁃3′，下游引物序列为 5′⁃CGTCACGACGGGTCAGAT⁃3′；GAPDH 基因（内参照）上游引物序列为 5′⁃CTATAAATTGAGCCCG⁃CAGC⁃3′，下游引物序列为 5′⁃GACCAAATCCGTT⁃GACTCCG ⁃3′；Real time PCR反应条件：95 ℃预变性10 min；95℃变性10 s、60℃退火10 s、72℃延伸10 s，共40个循环。以2⁃ΔΔCt值表示目的基因 mRNA的相对表达水平。

1.7 Western blot检测 E⁃cadherin、N⁃cadherin、vimentin、Snail及Slug蛋白的表达 将T24细胞接种于6孔板培养，待细胞处于对数生长期时，实验分组及处理同1.3继续培养48 h，PBS润洗2遍后加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，4℃裂解30 min，12 000 r/min离心后取上清液。再按照BCA试剂盒说明书测定总蛋白浓度后加入适量蛋白上样缓冲液，沸水浴加热10 min使蛋白变性后分装，-20℃保存。取60 μg总蛋白上样量，计算蛋白的上样体积，根据目的蛋白分子量大小选择合适比例的SDS⁃PAGE凝胶电泳后转印到PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭1 h，TBST润洗后分别加入兔抗人β⁃actin、E⁃cadherin、N⁃cadherin、vimentin、Snail及 Slug抗体4℃孵育过夜，抗体稀释度均为1∶1 000。TBST润洗10 min×3次，常温摇床下孵育荧光二抗（1∶5 000）1 h；用TBST溶液洗膜10 min×3次，荧光化学发光检测仪检测，图像扫描。采用Image J软件分析蛋白条带灰度值，以目的蛋白与β⁃actin条带的光密度比值表示目的蛋白相对表达量。实验重复3次。

1.8 统计学方法 采用SPSS 23.0统计软件，数据以表示，计量资料多组间均数比较采用ANOVA方差分析，进一步组间比较采用SNK⁃q法，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DCA对T24细胞克隆增殖能力的影响 实验组5、10、20 mmol/L浓度的每孔细胞克隆形成数量分别为（292.3 ± 20.5）个/孔、（178.7 ± 17.2）个/孔和（122.3±9.6）个/孔，明显低于对照组（416.3±12.6）个/孔，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图1。

2.2 DCA对T24细胞迁移活性的影响 划痕实验结果显示：与对照组相比，在5、10、20 mmol/L浓度的DCA作用24、48、72 h后，细胞迁移率呈现不同程度地降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1、图2。

图1 两组细胞克隆形成数量比较Fig.1 Comparison of the number of clones formed in the two groups

图2 细胞划痕实验检测两组细胞迁移能力（×100）Fig.2 Cell scratches were used to detect the migration ability of the two groups（× 100）

2.3 DCA对T24细胞侵袭活性的影响 Transwell实验结果显示：实验组用5、10、20 mmol/L DCA处理24 h后侵袭细胞数分别为（361.7±20）个/视野、（165.0 ± 17.1）个/视野、（71.0 ± 16.1）个/视野，均低于对照组的（536.7±27.6）个/视野，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图3。

2.4 DCA 对 E⁃cadherin、N⁃cadherin、vimentin、Snail及Slug的mRNA表达的影响 实验组用5、10、20 mmol/L DCA处理T24细胞48 h后，细胞中E⁃cadherin mRNA表达水平均高于对照组，而Snail、Slug、vimentin和N⁃cadherin mRNA表达水平均低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表1 两组细胞的迁移率比较Tab.1 Comparison of the mobility of the two groups±s

表1 两组细胞的迁移率比较Tab.1 Comparison of the mobility of the two groups±s

注：与对照组比较，*P＜0.01

组别实验组5 mmol/L 10 20对照组24 h 48 h 72 h 34.6±2.2*25.4±1.2*21.4±1.5*54.2±1.7 52.1±1.2*34.0±1.7*30.0±1.3*63.4±1.9 63.2±1.3*58.4±1.1*41.6±1.0*80.1±1.6

图3 Transwell检测两组细胞侵袭细胞数（×100）Fig.3 The number of invading cells were detected by Transwell in both groups（× 100）

表2 两组间mRNA相对表达量的比较Tab.2 Comparison of mRNA expression between the two groups ±s

表2 两组间mRNA相对表达量的比较Tab.2 Comparison of mRNA expression between the two groups ±s

注：与对照组比较，*P＜0.05

E⁃cadherin N⁃cadherin vimentin Snail Slug 组别实验组5 10 20对照组1.57±0.13*2.11±0.09*3.35±0.14*1.00±0.00 0.72±0.11*0.68±0.15*0.52±0.08*1.00±0.00 0.88±0.09*0.62±0.15*0.48±0.13*1.00±0.00 0.86±0.08*0.75±0.11*0.61±0.13*1.00±0.00 0.84±0.12*0.67±0.13*0.62±0.07*1.00±0.00

图4 Western blot检测两组细胞的EMT标记蛋白的表达Fig.4 The expression of EMT marker protein was detected by Western blot

2.5 DCA 对 E⁃cadherin、N⁃cadherin、vimentin、Snail及Slug的蛋白表达的影响 实验组用5、10、20 mmol/L DCA处理T24细胞48 h后，细胞中E⁃cadherin蛋白表达水平均高于对照组，而Snail、Slug、vimentin和N⁃cadherin蛋白表达水平均低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图4和表3。

3 讨论

能量代谢异常是恶性肿瘤最鲜明的特征之一，尤其是糖代谢异常，其中有氧糖酵解是恶性肿瘤能量代谢方面的最主要特征，即肿瘤细胞在充足的有氧条件下仍然优先通过糖酵解方式获取能量［7-8］，其生产的大量中间产物为肿瘤生长侵袭迁移提供帮助。DCA，又称二氯醋酸，是一种小分子代谢调节剂，临床上用于治疗乳酸中毒和线粒体遗传性疾病，其药理作用机制为通过抑制丙酮酸脱氢酶激酶（pyruvate dehydrogenase kinase，PDK）活性，上调丙酮酸脱氢酶（pyruvate dehydrogenase，PDH）活性，促进丙酮酸进入三羧酸循环从而减少乳酸生成［9］，从而抑制肿瘤细胞生长，但对正常细胞却无损害。近年来研究发现DCA具有明显抗肿瘤活性，但对于DCA作用于膀胱癌T24细胞的克隆形成、侵袭及迁移的影响在国内外却鲜有报道。因此，我们探讨DCA对膀胱癌T24细胞克隆形成、侵袭和迁移的影响，为逆转膀胱癌转移提供理论依据。

本研究表明，DCA能够明显抑制体外培养的膀胱癌T24细胞的克隆形成，推测DCA可能通过抑制膀胱癌T24细胞PDK激活PDH，从而改变膀胱癌细胞糖代谢途径，使癌细胞从依赖糖酵解获得能量向依赖氧化磷酸化获能发生转化。

细胞划痕实验显示，与对照组相比发现，实验组随DCA的浓度的增加和时间的延长，细胞迁移的总体宽度明显较对照组大。结合Transwell结果，实验组与对照组的侵袭细胞数相比，前者比后者明显减少，且呈浓度依赖性，差异均有统计学意义（均P＜0.05），提示DCA可以抑制T24细胞的侵袭能力，与细胞划痕实验结果相一致。

不同肿瘤细胞的发病机制不尽相同，但研究证实EMT是上皮源性肿瘤细胞发生发展的重要环节，与肿瘤细胞发生迁移和侵袭密切相关［2，10］。典型的EMT是指上皮细胞失去上皮特性，向间质细胞转化，表现为细胞间连接减少，从而增强癌细胞的侵袭及迁移能力，其主要特征为上皮标记物E⁃cadherin表达的减少，间质标记物vimentin和N⁃cadherin表达的增加［10-11］。Snail家族（包括Snail和Slug）是具有负调控作用的锌指转录因子，能够与E⁃cadherin相互作用，从而抑制 E⁃cadherin的表达［12］。大量研究发现膀胱癌的侵袭迁移与EMT密切相关，主要通过上调E⁃cadherin表达的同时，下调vimentin和N⁃cadherin表达，从而抑制膀胱癌细胞的侵袭迁移能力［2，13-14］。在临床研究方面同样发现EMT与膀胱癌患者密切相关，HENSLEY等［2］研究发现EMT与膀胱癌患者的临床病理分级分期及预后密切相关，认为EMT的特征性标记物可作为浸润性膀胱癌的潜在的肿瘤标记物。同时，SINGH等［15］研究认为EMT标记物可作为判断膀胱癌患者预后的一个有效的敏感性肿瘤标记物。本研究发现，DCA能够抑制T24细胞的侵袭迁移，但其机制尚未明确，所以我们探讨DCA抑制T24细胞侵袭迁移是否与EMT相关标记物的改变有关。

表3 两组间蛋白相对表达水平（灰度值）Tab.3 between the two groups of protein relative expression level（gray value） x±s

本研究通过Real time PCR法及Western blot法检测 EMT相关标记物 E⁃cadherin、N⁃cadherin、vimentin、Snail及Slug表达水平。Real time PCR结果显示：实验组T24细胞的E⁃cadherin表达上升，而Snail、Slug、vimentin和N⁃cadherin表达下降，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。这一结果，在Western blot检测蛋白的表达情况也得到验证。因此，我们推断DCA通过下调核转录因子Snail和Slug的表达，进而促进E⁃cadherin的表达，同时减少间质细胞标记物vimentin和N⁃cadherin的表达，抑制T24细胞发生EMT，降低膀胱癌细胞侵袭迁移的能力。但关于DCA抑制膀胱癌T24细胞的增殖、侵袭及迁移的确切分子机制还有待进一步研究，本课题组拟建立恶性肿瘤的裸鼠移植模型，进一步探讨DCA在动物水平的抗肿瘤效应。

综上所述，本研究应用DCA处理T24细胞，通过对T24细胞克隆形成能力、细胞侵袭力及迁移能力的观察，认为DCA可抑制T24细胞克隆形成能力，且对肿瘤的侵袭和迁移能力也有明显的抑制作用，其机制可能通过下调核转录因子Snail和Slug的表达，进而促进E⁃cadherin的表达，同时减少间质细胞标记物vimentin和N⁃cadherin的表达，抑制T24细胞发生EMT，降低膀胱癌细胞侵袭迁移的能力。

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