FAK 基因沉默对人舌鳞癌细胞CAL⁃27增殖与迁移能力的影响

陈凯 刘涛 李张维 李梁 潘宣

广东药科大学附属第一医院口腔科（广州 510080）

舌癌是口腔颌面部常见的恶性肿瘤之一，其多数为鳞癌。近年来，舌鳞癌的发病率有不断升高的趋势，且发病年龄趋于年轻化［1-2］。舌鳞癌的一般恶性程度高，生长快，浸润性强；舌体本身活动频繁，具有丰富的淋巴管供应和血液循环，常发生较高的颈部淋巴结转移，这些因素均直接影响舌癌患者的预后及生存。因此，关于舌鳞癌的形成、侵袭及转移机制成为了当下的研究重点。

黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）是整合素信号通路中的关键分子，与细胞的黏附功能关系密切。近年来的相关研究表明，FAK可通过多条信号通路参与肿瘤细胞的黏附、增殖、侵袭及凋亡等生物学过程。然而，目前有关FAK基因与舌鳞癌的相关性的研究较少，其确切分子机制尚不清楚。本研究通过采用RNA干扰（RNA interfer⁃ence，RNAi）技术对人舌鳞癌细胞株 CAL⁃27进行FAK基因沉默，探讨FAK基因干扰对舌鳞癌细胞株CAL⁃27增殖及迁移能力的影响，以期为进一步深入研究FAK基因在舌鳞癌细胞中异常表达的分子机制提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料 舌鳞癌细胞株CAL⁃27由李劲松教授（中山大学附属孙逸仙纪念医院口腔颌面外科）惠赠。DMEM培养基购自美国Gibco公司；胎牛血清FBS购自杭州四季青公司；LipofectamineTM2000购自美国Life Technologies公司；Trizol试剂盒购自美国TIANGEN公司；GoScript反转录系统和GoTaq qPCR Master Mix试剂盒购自美国Promega公司；噻唑蓝（MTT）和二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma公司；兔抗人FAK单克隆抗体购自英国Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 FAK siRNA基因序列及其引物的设计和合成 在本课题组前期的预实验研究中，针对FAK设计三条siRNA，经过细胞转染，用荧光定量PCR方法筛选出其中具有最佳抑制效果的FAK siR⁃NA，由广州赛哲生物科技股份有限公司合成。选用的特异性FAK siRNA基因序列为：正义链：CAG⁃GUGAAGAGCGAUUAUATT；反义链：UAUAAUCG⁃CUCUUCACCUGTT。FAK siRNA序列引物由广州赛哲生物科技股份有限公司设计合成，上游：5′⁃TGTGGGTAAACCAGATCCTGC⁃3′；下游：5′⁃CT⁃GAAGCTTGACACCCTCGT⁃3′。同时设计了 GAP⁃DH 作为内参物，上游：5′⁃TCATGAAGTGTGACGT⁃GGACATC ⁃3′；下 游 ：5′⁃CAGGAGGAGCAAT⁃GATCTTGATCT⁃3′。

1.2.2 细胞培养 用0.25%胰蛋白酶消化CAL⁃27细胞，以含10%血清的DMEM培养基调整细胞密度后，按照每孔5×105个细胞接种到六孔板中，置于置于37℃，5%CO2培养箱培养，16～24 h后待细胞密度生长到60%～70%时即可用于转染。

1.2.3 分组和转染 本试验设空白对照组、阴性对照组和实验组。实验组使用FAK siRNA干扰质粒进行转染；空白对照组未转染任何RNA；阴性对照组使用无关序列RNA进行转染。准备好细胞后，按照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书进行转染。

1.2.4 qPCR检测FAK mRNA的表达 （1）RNA的提取：取处于对数生长期且状态良好的细胞，按照Trizol试剂盒操作说明书，通过细胞处理，分相及RNA沉淀、清洗、溶解5个步骤提取总RNA，检测总RNA的浓度和纯度。（2）逆转录反应：根据GoScript反转录系统试剂盒操作说明书，总RNA通过逆转录反应获取cDNA。（3）进行qPCR反应：PCR反应条件为：95℃预变性10 min后，再95℃变性15 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，总共40个循环。反应完成后，结果在PCR仪器中自动读取和生成，仪器配套携带的软件系统直接对所得结果进行比较分析。

1.2.5 Western blotting检测FAK蛋白的表达（1）总蛋白提取：在细胞中加入细胞裂解液，冰上裂解，离心，收集上清。（2）测定蛋白浓度：制备1 mg/mL的标准蛋白溶液及考马斯亮蓝G⁃250反应液，595 nm测定光吸收值，绘制标准曲线，换算样品的蛋白浓度。（3）上样：根据Wes 12～ 230 kDa Rabbit Master kit试剂盒和Wes 12～230 kDa Master kit with split Buffer试剂盒说明书，完成加样。将样品放入Proteinsimple Wes仪器。其中，FAK一抗及内参GAPDH一抗均为1∶50稀释，二抗为试剂盒自带。设置相关运行参数，运行后得出结果。

1.2.6 MTT实验检测细胞增殖能力的改变 将细胞按接种于孔板，37℃、5%CO2培养箱中培养；隔天待细胞贴壁后，转染实验组及阴性对照组；分别于转染后24、48和72 h加入含量为5 mg/mL的MTT溶液，37 °C、5%CO2培养箱中孵育4 h；吸尽各孔内培养液，加入DMSO，水平震荡10 min，用酶标仪测定492 nm处吸光值。

1.2.7 Transwell小室法检测细胞迁移能力 转染48 h后，将细胞消化成单个悬液，配制浓度为4×105个/mL的细胞悬液；预先将transwell小室置于无血清DMEM培养液中平衡1 h；上室中加入细胞悬液，下室加入10%FBS的DMEM培养液，置于37℃，5%CO2培养箱中培养20 h；0.1%结晶紫常温固定染色30 min，用棉棒轻轻擦去上室上表面的细胞；显微镜下随机选取5个视野拍照、计数。

1.3 统计学方法 利用SPSS 19.0统计分析软件对相关数据进行统计学处理，实验数据采用均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为统计学差异显著，P＜0.01为统计学差异极显著。

2 结果

2.1 转染siRNA对CAL⁃27细胞FAK mRNA表达的影响 3组中FAK mRNA相对含量如图1所示。实验组表达量分别为上述2个对照组的23.32%和21.25%，干扰效率为76.68%和78.75%。实验组中FAK mRNA的表达显著下调，明显低于空白对照组和阴性对照组，差异有统计学意义（F=1 060.91，P＜ 0.01）。

2.2 转染siRNA对CAL⁃27细胞FAK蛋白表达的影响 三组中FAK蛋白的表达量如图2和图3所示。实验组表达量分别为上述2个对照组的40.46%和49.59%。实验组中FAK蛋白的表达显著下调，明显低于空白对照组和阴性对照组，差异有统计学意义（F=8.07，P＜0.05）。

图1 各组细胞FAK mRNA表达变化Fig.1 The expression of FAK mRNA in each group

图2 各组细胞FAK蛋白表达变化Fig.2 The expression of FAK protein in each group

图3 各组细胞FAK蛋白表达水平Fig.3 The level of FAK protein expression in each group

2.3 转染siRNA对CAL⁃27细胞增殖能力的影响 MTT增殖曲线反映了各个时间点细胞的增殖情况（图4）。在48和72 h，两个对照组的吸光度值均明显高于实验组，差异具有统计学意义（F48h=558.32，P48h＜ 0.01；F72h=120.52，P72h＜ 0.01）。而在24 h三组间差异无显著性（F24h=1.32，P24h＞0.05）。沉默FAK基因，舌鳞癌细胞的增殖能力明显受到抑制。

图4 各组细胞增殖能力的变化Fig.4 The proliferation ability of cells in each group

2.4 转染siRNA对CAL⁃27细胞迁移能力的影响 Transwell小室实验显示，在空白对照组、阴性对照组及实验组，每个视野中穿过聚碳酸酯膜迁移至下室的细胞数分别为47.27±5.10，49.80±6.80及34.13±3.30（图5）。实验组的迁移细胞个数明显少于两个对照组，差异有统计学意义（F=7.6414，P＜0.05）。沉默FAK基因，舌鳞癌细胞的迁移能力明显受到抑制。

3 讨论

FAK也被称为PTKⅡ，是整合素信号通路中的关键分子，与细胞的黏附功能关系密切。FAK结构较为特殊，其本质上是一种非受体酪氨酸激酶，缺乏跨膜区，是纯粹的细胞质酪氨酸激酶，但又不含有胞质酪氨酸激酶常有的SH2和SH3结构域［3］。FAK能够催化多种底物蛋白，在细胞生长、增殖、分化中具有重要作用。在生理状态下，FAK广泛分布于人体的表皮细胞、单核细胞及成纤维细胞等细胞中；但近年来，越来越多的研究表明，在病理状态下，FAK的高表达与多种不同组织起源肿瘤的分化程度及转移状态密切相关［4-6］。在口腔鳞状细胞癌中，已有研究发现FAK和p53的表达呈负相关，推测FAK可能参与调控了p53表达的下调，进而遏制了肿瘤细胞的凋亡过程［7］。对舌鳞状细胞癌的研究发现，通过抑制FAK Tyr397和AKT Ser473位点的磷酸化，可以在极大程度上降低舌鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，进而有效地抑制肿瘤的发生和发展［8］。

本研究运用RNAi介导FAK基因沉默，分析对舌鳞癌CAL⁃27细胞增殖与侵袭能力的影响。实验结果显示，在转染siRNA的CAL⁃27细胞中，FAK的mRNA和蛋白的表达量均明显下降，这表明FAK在mRNA水平表达和蛋白水平表达上具有一致性，siRNA转染能有效抑制FAK mRNA和FAK蛋白的表达水平。

同时，本研究结果还显示，与空白对照组及阴性对照组比较，siRNA转染的CAL⁃27细胞增殖能力和迁移能力均受到了明显抑制，这与上述文献［7-8］的报道基本一致。FAK是多条信号转导通路的关键节点，FAK通过激活PI3K⁃AKT等信号通路增加细胞DNA合成和加快G/S期的转换，促进细胞的增殖［9-11］；还可在转录水平上调控细胞周期蛋白CyclinD 1的表达［12］。细胞迁移过程包括细胞前沿伪足的形成，新黏附的建立、细胞体的收缩和尾部的分离。在迁移过程中，FAK可以作为一种接近整合素和生长因子受体的蛋白，发挥调节细胞迁移的作用；FAK还能通过各种信号通路激活Rac、ERK或Rho，调节肌动蛋白组装和细胞骨架结构，参与细胞迁移的调控［13-16］。FAK沉默后，可能影响了这些信号通路的激活及调控蛋白功能的发挥，进而引起肿瘤细胞增殖能力和迁移能力的下降。

综合上述，本实验通过RNAi技术沉默FAK，发现FAK表达的下调可以抑制舌鳞癌细胞CAL⁃27的增殖和迁移能力；提示FAK有望成为抑制舌鳞癌生长和转移的新靶点。但目前关于FAK在舌鳞癌发生、发展及转移中的具体功能、所处地位的研究正处于起步阶段，其对舌鳞癌细胞生物学行为调控的具体机制仍未完全阐明，仍需进一步的实验探索。

图5 沉默FAK基因对CAL⁃27细胞迁移能力的影响Fig.5 Effect of silencing FAK gene on migration of CAL⁃27 cells

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