RNA结合蛋白Larp1在卵巢癌侵袭转移中的作用及机制

戴燕 金世光 王薛洁 杨鑫泉 王大新

江苏省苏北人民医院 1医学实验研究中心，2急诊科（江苏扬州 225001）

卵巢恶性肿瘤的发生率及病死率有明显增长趋势，其预后差、致死率高［1-4］。卵巢癌细胞中促生长因子TGF⁃β、EGF与其受体在卵巢癌中过表达并能激活下游信号通路，是癌细胞发生EMT的重要信号，促进癌细胞侵袭转移［5-6］。有文献报道RNA结合蛋白Larp1在上皮性肿瘤细胞中对mTOR mRNA的翻译起始有重要调控作用。同时发现敲除Larp1蛋白能明显抑制宫颈癌HeLa细胞的侵袭转移，因此推测Larp1表达与肿瘤发展及预后关系密切［7-10］。Larp1 可与 PABP、启动子elF4E形成聚合体，同时能与前多聚核糖体亚基60S和80S结合，在RNA转录翻译过程中发挥重要作用［11-12］。在前期研究基础上，本文拟通过检测卵巢癌细胞中Larp1与促生长因子对Larp1表达的影响，进一步探讨Larp1对EMT转化与卵巢癌细胞侵袭转移能力的作用，将为诊断治疗卵巢癌提供新的生物标记与治疗方向。

1 材料与方法

1.1 试剂与抗体 10%胎牛血清RPMI⁃1640培养液（Sigma⁃Aldrich）。Western Blotting实验使用抗体Larp1（Strategic Diagnostic）与 β ⁃tubulin（Sigma⁃Al⁃drich），二抗 Anti⁃rabbit⁃HRP（Glostrup）、Anti⁃rat⁃HRP（Santa Cruz），稀释比例均为1∶5 000。免疫荧光染色实验中Larp1抗体稀释比例为1∶100，Alexa⁃Fluor 488（Invitrogen）稀释比例为1∶500。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 卵巢癌细胞培养于RPMI⁃1640培养基（含有10%FCS）（Invitrogen）并放置于5%CO2/37℃孵箱中培养。

1.2.2 构建DNA质粒载体 GFP⁃Larp1从OriGene（Rockville）购入，pCDNA/GW⁃53/CAT（Invitrogen）在后续转染实验中作为空载体质粒组。Gateway T⁃RexTM的表达体系用于构建稳定转染Larp1过表达的SKOV⁃3细胞。Larp1基因成功克隆至pT⁃RExTM⁃DEST⁃30（Invitrogen）。

1.2.3 Larp1在卵巢癌细胞中的表达水平检测 细胞溶解于裂解液后用PBS清洗两次，加入200 μL裂解液，4℃离心10 min。通过BCA法（Thermo Scientific）确定浓度并稀释后使用SDS⁃PAGE电泳法分离并转膜（BioRad），接着在5%的脱脂牛奶（溶于 0.05%PBS⁃T）（Sigma⁃Aldrich）恒温封闭1 h（37℃）；加入一抗4℃孵育过夜；PBS⁃T漂洗3次，每次5 min；加二抗后37 ℃孵育2 h，PBS⁃T漂洗3次，每次5 min；ECL（Millipore）显影，暗室压片。

1.2.4 细胞转染含有GFP⁃Larp1的DNA质粒 SKOV⁃3与OVCAR⁃3细胞汇合率达90%时转移至6孔板，LipofectamineTM（Invitrogen）或者Effectene®（Qiagen）为溶剂。OVCAR⁃3分别转染0.5、1、2 μg DNA（GFP⁃Larp1）质粒，未转染细胞为对照组。另外SKOV⁃3细胞也如上转染1与 2 μg DNA（GFP⁃Larp1）质粒，或者转染0.5、1 、2 μg DNA（pT⁃REx⁃Larp1），转染24 h后获得细胞裂解物。

1.2.5 免疫荧光染色 在六孔板中放置盖玻片并培养SKOV⁃3细胞，接着室温下加入PHEM固定10 min后加入PBSTB封闭1 h，再加入一抗孵育过夜。细胞经过两次PBS清洗后，加入Alexa Fluor®488（Invitrogen）孵育1 h，再PBS漂洗3次后封片。

1.2.6 激光共聚焦显微镜 蛋白样品荧光染色后通过激光共聚焦显微镜（Leica Microsystems）观察并获取图像，ImageJ软件处理图像（NIH）。

1.2.7 3D趋化侵袭实验 TGF⁃β（Invitrogen）、bF⁃GF（Invitrogen）、EGF（Promega）、PBS 加入MatrigelTM。液状MatrigelTM（40 μL）加入Chamber Slides在37 ℃下聚合20 min。GFP⁃Larp1转染与对照组细胞转染过夜后培养于100 mm培养皿中（5×103细胞）。4 h后更换为降血清培养液。MatrigelTM侵袭细胞15 min后固定并染色（转染48 h后），GFP⁃Larp1表达细胞与空载体质粒转染细胞由AlexaFluor®568和Alexa Fluor®488染色，其余步骤均按照之前所述重复。

1.2.8 定点趋化侵袭实验 在液状MatrigelTM（BD）基底膜内分别加入TGF⁃β（0.3 ng/μL）、EGF（3 ng/μL）、bFGF（3 ng/μL）、PBS（对 照 组）。MatrigelTM在37 ℃下聚合15 min，OVCAR⁃3与SKOV⁃3细胞转染过夜后转移至100 mm培养皿中（7×105细胞），转染48 h后观察侵袭细胞数量（Nikon）。

1.3 数据分析 应用GraphPad Prism 4.1软件进行数据分析。P≤0.05认为差异有统计学意义。

图1 Larp1蛋白在各卵巢癌细胞株内的表达与分布Fig.1 The localization and endogenous expression of Larp1 in ovarian cancer cells

2 结果

2.1 Larp1在OVCAR⁃3与SKOV⁃3内表达水平最低且分布于细胞核内 Western Blot结果显示SKOV⁃3与OVCAR⁃3的Larp1蛋白表达水平相对较低（图1A），因此选取OVCAR⁃3与SKOV⁃3进行转染实验。另外免疫荧光染色实验发现Larp1主要集中分布于SKOV⁃3细胞核内（图1B）。

2.2 在OVCAR⁃3与SKOV⁃3内转染GFP⁃Larp1质粒使其过表达 如图2A所示，在使用10%SDS⁃PGGE分离蛋白时Larp1与GFP⁃Larp1（150 kDa）较难区分，因此进一步用8%SDS⁃PGGE分离蛋白。当 0.5 μg DNA转染到OVCAR⁃3细胞且DNA与LipofectamineTM转染浓度比为1∶1.5时，转染效果最优（图2B）。SKOV⁃3细胞中转染2 μg DNA 且比例为1∶2时，GFP⁃Larp1表达量最高（图2C）。当2 μg DNA：Effectene®溶剂为1∶1.25时，转染结果最理想，沿用此比例进行后续实验（图2D）。

图2 优化GFP⁃Larp1 DNA质粒转染浓度Fig.2 Transfection optimisation for Larp1 DNA constructs

图3 OVCAR⁃3细胞在3D侵袭实验中形态变化Fig.3 OVCAR⁃3 cells in 3D invasion

2.3 通过3D细胞侵袭法检测Larp⁃1胞内定位与分布 研究结果显示在MatrigelTM中加入诱导EMT的促生长因子，OVCAR⁃3细胞通常位于MatrigelTM表面，且未发现明显突触伸入基底膜胶。而相比于没有生成突触的细胞，那些生成伸入基底膜胶突触的细胞或者已经大部分嵌入基底膜胶的细胞呈近圆形（图3A、C）。在促生长因子与PBS诱导下，转移的肿瘤细胞易聚集且有些表现为成纤维细胞形态（图4A）。此外，Larp1在转染细胞内位于细胞质内，而在空载体转染细胞内（PBS干预）Larp1分布在细胞核内（图4B）。转染GFP⁃Larp1的SKOV⁃3细胞在TGF⁃β/MatrigelTM内侵入基底膜最深，集体迁移现象最明显，细胞内Larp1表达水平最高，细胞内均生成长肌动蛋白突触，深入MatrigelTM内同时Larp1与圆形突触共定位（图4C、D）。

2.4 Larp1蛋白过表达会提高OVCAR⁃3与SKOV⁃3细胞侵袭能力 本研究采用定点趋化实验来检测GFP⁃Larp1过表达与空载体转染的OVCAR⁃3与SKOV⁃3细胞对基底膜胶的侵袭能力差异，发现随着位置的外移降低浓度，细胞会向浓度高的中间位置侵袭（图5A），同时20×物镜观察GFP⁃Larp1转染细胞（图5B）。从细胞对基底膜胶的不同扭曲程度可以推论SKOV⁃3比OVCAR⁃3细胞侵略性更强（图5C）。另外结果显示在PBS中，GFP⁃Larp1过表达细胞与对照组细胞相比趋化侵袭反应无明显区别。而在bFGF干预下，OVCAR⁃3细胞过表达Larp1后趋化侵袭现象十分明显，其他未转染的细胞趋化侵袭数量在bFGF、EGF、TGF⁃β环境下并未表现出明显区别（图5C与D）。此外，转染GFP⁃Larp1的SKOV⁃3细胞对bFGF的趋化侵袭比转染空载体质粒细胞更明显（P=0.07）（图5D）。

图4 SKOV⁃3细胞在3D侵袭实验中形态变化Fig.4 SKOV⁃3 cells in 3D invasion

图5 定点趋化侵袭检测Fig5 Spot chemoinvasion assay

3 讨论

卵巢癌细胞的侵袭和转移是卵巢癌致死率居高不下的主要原因，Larp1表达上调后对上皮性肿瘤细胞的EMT及侵袭转移有正调控作用［8，12］。为了进一步探讨Larp1在卵巢肿瘤侵袭转移机制中的作用，本研究首先通过3D侵袭实验发现OVCAR⁃3细胞内GFP⁃Larp1与Larp1在细胞边缘形成泡状肌动蛋白突触，而SKOV⁃3细胞在TGF⁃β/MatrigelTM中有应力纤维生成并与Larp1共定位。同时GFP⁃Larp1高表达的SKOV⁃3细胞内肌动蛋白突触高度集中并延展，突触形成最多。这些突触与板状伪足形成、附着底层等过程都有直接关系，Larp1与突触共定位证明Larp1过表达对细胞侵袭转移能力的增强有重要作用。最后定点趋化侵袭实验结果显示转染Larp1的OVCAR⁃3与SKOV⁃3细胞对促生长因子的趋化侵袭现象比对照组更明显，推测Larp1与促生长因子可能通过相互作用促进EMT并增强细胞侵袭转移能力。综上所述Larp1过表达能通过与促生长因子间的相互作用来促进细胞EMT转化，同时促进肌动蛋白突触形成增强卵巢恶性肿瘤的侵袭转移能力，但其具体分子机制尚不明确，仍需进一步体内体外实验来阐明，这将为卵巢肿瘤的侵袭转移提供新的生物标记与治疗方向。

［1］贺彬彬，复发性卵巢癌的治疗现状和进展［J］.实用医学杂志，2010，26（8）：1280⁃1281.

［2］CUNNEA P，STRONACH E A.Modeling platinum sensitive and resistant high⁃grade serous ovarian cancer：development and applications of experimental systems［J］.Front Oncol，2014，4：81.

［3］AMOROSO M R，MATASSA D S，AGLIARULO I，et al.TRAP1 downregulation in human ovarian cancer enhances inva⁃sion and epithelial⁃mesenchymal transition［J］.Cell Death Dis，2016，7（12）：e2522.

［4］李林均，余建云，许涛，等.晚期上皮卵巢癌患者新辅助化疗的影响因素分析［J］.实用医学杂志，2016，32（9）：1461⁃1463.

［5］CHEN Y，WANG D D，WU Y P，et al.MDM2 promotes epi⁃thelial⁃mesenchymal transition and metastasis of ovarian cancer SKOV3 cells［J］.Br J Cancer，2017，117（8）：1192⁃1201.

［6］HASLEHURST A M，KOTI M，DHARSEE M，et al.EMT tran⁃scription factors snail and slug directly contribute to cisplatin re⁃sistance in ovarian cancer［J］.BMC Cancer，2012，12：91.

［7］MURA M，HOPKINS T G，MICHAEL T，et al.LARP1 post⁃transcriptionally regulates mTOR and contributes to cancer pro⁃gression［J］.Oncogene，2015，34（39）：5025⁃5036.

［8］LAHR R M，FONSECA B D，CIOTTI G E，et al.La⁃related protein 1（LARP1）binds the mRNA cap，blocking eIF4F as⁃sembly on TOP mRNAs［J］.Elife，2017，6.

［9］BURROWS C，ABD LATIP N，LAM S J，et al.The RNA bind⁃ing protein Larp1 regulates cell division，apoptosis and cell mi⁃gration［J］.Nucleic acids research，2010；38（16）：5542⁃5553.

［10］MURA M，HOPKINS T G，MICHAEL T，et al.LARP1 post⁃transcriptionally regulates mTOR and contributes to cancer pro⁃gression［J］.Oncogene，2014，34（39）：5025⁃5036.

［11］AOKI K，ADACHI S，HOMOTO M，et al.LARP1 specifically recognizes the 3′terminus of poly（A）mRNA［J］.FEBS Lett，2013，587（14）：2173⁃2178.

［12］DENG J，WANG L，CHEN H，et al.Targeting epithelial⁃mes⁃enchymal transition and cancer stem cells for chemoresistant ovarian cancer［J］.Oncotarget，2016，7（34）：55771⁃55788.