靶向抑制白细胞介素6受体对急性心梗后白细胞产生的影响

崔春便 贾新未 王艳飞 李雅 王占启 王敬

河北大学附属医院（河北保定 071000）

心肌梗死（myocardial infarction，MI）发生后，心肌每天从循环系统招募数十万白细胞，骨髓造血系统也迅速启动造血生成［1］，同时交感神经也会刺激造血祖细胞迁移至脾脏，产生骨髓外造血［2］，分化出大量白细胞，进一步促进炎症的产生，加重心机重构，造成巨大危害。因此，研究MI发生后对白细胞生成的影响，对抑制MI后炎症加重有重要的临床意义。

白细胞介素 6（interleukin 6，IL⁃6）是多源高效的细胞因子，其与细胞膜上的IL⁃6受体（IL⁃6R）结合后激活并促进炎症的发生［3］。研究表明IL⁃6可促进造血干细胞的产生，并在血液细胞分化中起重要作用［4-5］。同时，研究表明MI发生后会释放大量可溶性细胞因子，如C3、C4、IL⁃1、IL⁃4、IL⁃6 等［6］，但 MI发生后 IL⁃6 是否可以直接促进白细胞产生目前并无相关报道。本研究旨在探讨MI发生后，IL⁃6与白细胞产生的关系，靶向抑制IL⁃6R对机体白细胞产生的影响，为寻找临床治疗MI后改善心肌重构的新靶点提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 IL⁃6受体抑制剂Tocilizumab托珠单抗注射液购自Roche/Genentech公司，威斯塔大鼠（8～12周龄）购自北京维通利华实验动物有限公司，胶原酶购自SIGMA公司，鼠B220、CD11b、Ly6G、CD31、鼠平滑肌肌动蛋白（α⁃smooth muscle actin，αSMA）、胶原蛋白1（collagen⁃1）抗体购自eBiosci⁃ence公司，IL⁃6 ELISA检测试剂盒购自R&D Sys⁃tems公司，FITC/APC溴脱氧尿苷（Bromodeoxyuri⁃dine，BrdU）细胞增殖检测试剂盒、重组鼠源IL⁃6（Recombinant mouse IL⁃6，RmIL⁃6）购自BD公司。

1.2 方法

1.2.1 心梗动物模型的构建 大鼠气管插管，吸入麻醉后消毒，沿左侧第4胁间做横向小切口，挤压胸腔，使心脏挤出并堵塞切口，或用7-0号细线结扎将心脏冠状动脉左前降支结扎，将心脏复位并缝合胸腔，抽出胸腔残余气体，制做MI模型［7］。

1.2.2 不同部位IL⁃6的浓度 大鼠心脏取血，室温下凝固20 min，2 000 G离心后，吸取血清待测。将鼠处死，取心脏，显微镜下将梗死和非梗死部分分离，冰上将组织机械匀浆并加入RIPAA buffer消化30 min，12 000 G离心15 min，吸取上清待测。骨髓待测样处理同心脏。将不同组织的待测样用IL⁃6检测试剂盒检测。

1.2.3 骨髓造血干细胞增殖情况检测 取未经处理、注射RmIL⁃6及行心梗模型手术后Tocilizumab治疗及未经治疗的大鼠的骼组织，胶原酶消化后，经细胞筛过滤后获取骨髓细胞，流式细胞仪分选出骨骼造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）。将HSC细胞与FITC/APC溴脱氧尿（BrdU）共同孵育染色后，流式细胞术分析。

1.2.4 白细胞检测 MI 48 h后，取对照小鼠、Tocilizumab处理与未处理的MI大鼠血液，血常规细胞计数。

1.2.5 靶向抑制IL⁃6R 心梗手术后2 h开始治疗，通过皮下注射IL⁃6R抑制剂Tocilizumab，每天2次。

1.2.6 心肌组织炎症检测 取未经任何处理、MI术后未处理及术后Tocilizumab治疗7 d的大鼠MI区组织，免疫组化检测髓系细胞（CD11b）及中性粒细胞（Ly6G）的情况，显微镜观察。

1.2.7 心肌纤维化检测 取未经任何处理、MI术后未处理及术后Tocilizumab治疗7 d的大鼠MI区组织，利用免疫组化技术标记MI区平滑肌肌动蛋白（αSMA）、心肌胶原沉着情况（collagen⁃1）及新生血管情况（CD31）。

1.3 统计学方法 用SPSS 20.0软件进行统计分析，数据采用均数±标准差，调查组间比较采用方差分析，增殖期HSC比率的比较采用卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠心梗手术后促进不同组织IL⁃6的表达 见图1，笔者发现在大鼠MI发生后，在心肌组织、血清及骨髓组织的IL⁃6水平显著高于未有MI的大鼠组（对照组）。在心肌和血清组织中，IL⁃6在心梗出现后24 h后升高最为明显（P＜0.05），MI发生72 h后IL⁃6水平有所降低，并显著低于24 h水平（P＜0.05）。情况不同的是，在MI发生72 h后，骨髓组织中有较对照组明显增高的IL⁃6表达（P＜ 0.05）。

图1 IL⁃6在大鼠心梗后不同时间内不同组织中的水平Fig.1 The expression level of different tissues in different times

2.2 IL⁃6促进骨髓造血干细胞增殖 见图2，为了验证心梗发生后释放的IL⁃6能否刺激造血干细胞的产生，分离大鼠骨髓HSC并用只能标记增殖期的BrdU染色进行流式分析。结果表明，在心梗发生48 h后，骨髓增殖期（S+G2/M期）HSC的比例显著高于对照组（P＜0.05）。用RmIL⁃6处理的大鼠，骨髓增殖期（S+G2/M期）HSC的比例较对照组升高的更为明显（P＜0.05）。

2.3 IL⁃6促进白细胞的产生 MI模型术后48 h抽取对照组、MI组及RmIL⁃6组大鼠血液进行血常规WBC计数检测。注射了RmIL⁃6及MI 48 h模型大鼠血WBC计数明显高于对照组（P＜0.05）。见图3。

2.4 靶向抑制IL⁃6R抑制心梗后HSC的增殖 见图4，利用IL⁃6R靶向抑制剂Tocilizumab治疗MI 48 h后的大鼠，其骨髓处于增殖期HSC的比例明显被抑制（P＜0.05），接近至对照组水平（P＞0.05）。说明Tocilizumab可以抑制骨髓HSC的增殖。

2.5 靶向抑制IL⁃6R抑制白细胞的产生 为了验证IL⁃6促进WBC产生的效果是否会被IL⁃6R特异性靶向抑制剂Tocilizumab所抑制，笔者进而又抽取MI 48 h大鼠模型、MI用Tocilizumab处理后及对照大鼠的血液，行血常规WBC计数。经Tocilizum⁃ab处理后的MI大鼠，其WBC的产生明显被抑制（P＜0.05）。见图5。

2.6 靶向抑制IL⁃6R抑制心肌组织炎症的产生 在大鼠MI后7 d将大鼠处死，取出心脏组织，对梗死区行免疫组化分析，检测心肌组织内的骨髓来源细胞（CD11b）及中性粒细胞（Ly6G）的分布情况。见图6，对照组CD11b及Ly6G阳性细胞数目明显多于Tocilizumab治疗组。说明Tocilizumab可以抑制心梗区炎性细胞浸润。

图2 不同情况下骨髓中S+G2/M期造血干细胞所占的比例Fig.2 The proportion of S+G2/M HSC of marrow in different conditions

图3 大鼠血常规白细胞计数Fig.3 The number of WBC of rat

图4 不同情况下骨髓中S+G2/M期造血干细胞所占的比例Fig.4 The proportion of S+G2/M HSC of marrow in different conditions

图5 大鼠血常规白细胞计数Fig.5 The number of WBC of rat

2.7 靶向抑制IL⁃6R抑制心肌纤维化 在大鼠MI后7 d处死大鼠并取出心脏，利用免疫组化技术标记MI区平滑肌肌动蛋白（αSMA）、心肌胶原沉着情况（collagen⁃1）及新生血管情况（CD31）。Tocilizum⁃ab治疗后，心肌成纤维细胞标记物αSMA及colla⁃gen⁃1明显减少，但新生毛细血管内皮细胞（CD31）并没有太大改变。见图7。

3 讨论

MI及动脉粥样硬化在临床上会引起包括骨髓激活在内的复杂的严重并发症［8］。正常情况下，尽管骨髓每天都会产生数以亿计的血细胞，但骨髓增生的HSC通常只有很少一部分会进入血液循，且受到严格的调控。如果骨髓HSC增殖过于活跃，那么骨髓中的造血微环境便会产生一系列信号如CXCL12等使HSC静止。当机体受到感染时，大量信号分子如干扰素、Toll样受体等会释放进血，促进白细胞的产生，有利于机体对病原体的防御。同时，MI患者的血液样本中可检测到大量的巨噬细胞［9］，且研究证实心血管患者的病死率与血液中的白细胞水平存在相关性［10-11］。但MI后白细胞的产生是否和内源性炎性因子直接有关，目前尚不清楚。

图6 大鼠MI 7 d后梗死区心肌组织炎性细胞的免疫组化图Fig.6 The immunohistochemistry staining of inflammatory cells in MI area after MI 7 days

图7 平滑肌肌动蛋白（αSMA）、心肌胶原沉着情况（collagen⁃1）及新生血管情况（CD31）的免疫组化图Fig.7 The immunohistochemistry staining of αSMA，collagen⁃1 and CD31

人类患者MI及缺血再灌注损伤发生后，心肌分泌大量IL⁃6，其血清水平显著升高［12-13］。因此，笔者首先制做了大鼠MI模型，并利用ELISA技术检测到大鼠不同组织中的IL⁃6水平，证明MI发生后不同组织IL⁃6均会不同程度增高。尽管IL⁃6存在促炎和抗炎的双重复杂作用［14］，但在MI中的研究表明，MI发生后细胞因子，如IL⁃6等的大量释放是许多功能蛋白表达和活化的诱导因素［15］，在造血及HSC分化中起重要作用［4-5］。将RmIL⁃6注射给大鼠后同样发现大鼠骨髓中处于增殖期的HSC比率大大增加，进一步用血常规计数表明大鼠MI后血液中的白细胞数量明显增加。这证明了MI后心肌分泌的IL⁃6可直接作用于骨髓造血系统，增加血液白细胞的数量。MI发生后心肌组织会有大量炎性细胞浸润，这些炎性细胞会通过吞噬细胞碎片、激活基质金属蛋白酶（atrix metalloprotein⁃ase，MMP）重构心肌细胞外基质（xtracellular ma⁃trix，ECM），并分泌生长因子，促进颗粒状血管生成和ECM蛋白沉积，对心肌有极大的毒性作用［16-17］。因此，如何防止梗死区扩大、改善心肌重构是当代心血管医生治疗MI的重要任务，控制炎性细胞在心肌组织的浸润是一个重要的选项。

有研究表明，采用特异性抗体靶向WBC，抑制它的激活、黏附及溢出等在改善MI大鼠心肌重构方面起着重要作用［18-19］。但针对WBC的这些作用可能导致体内WBC功能异常，造成免疫系统破坏。Tocilizumab是FDA于2010年批准，目前在我国上市的唯一一种针对IL⁃6R的特异性靶向抑制剂，已用于风湿性关节炎的治疗。本研究在MI大鼠给予皮下注射Tocilizumab后，大鼠骨髓HSC增殖明显被抑制，血液中的WBC数量明显降低。在MI大鼠心肌组织中，炎性细胞浸润明显减少、心肌纤维化程度较对照组明显改善，这说明Tocili⁃zumab对于改善大鼠MI后心肌重构有着积极作用。

本研究表明，MI发生后心肌细胞分泌大量的IL⁃6，当它进入血液后可以直接作用于骨髓造血系统，刺激HSC的产生并向WBC分化，加重心肌的重构。用IL⁃6R靶向抑制剂Tocilizumab治疗后，IL⁃6与受体结合被阻断，骨髓HSC比率降至正常水平，血WBC数量减少，心肌重构得以改善。Tocilizumab可以抑制心梗后白细胞的产生并抑制心肌重构。

本研究首次证明了MI发生后IL⁃6可直接刺激HSC增殖并向WBC分化，从而加重心肌重构。进而用IL⁃6R抑制剂阻断Tocilizumab IL⁃6R取得了良好的效果。但本研究未采用IL⁃6R基因缺失小鼠进行验证，有待后续进一步验证。

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