GLP⁃1对NAFLD大鼠肝功能及TLR4/NF⁃κB信号通路的影响

陈益耀 陈轶 何周桃 蔡曼妮

海南省人民医院消化内科（海南海口 570311）

非酒精性脂肪肝（non⁃alcoholic fatty liver dis⁃ease，NAFLD）为肝脏内的甘油三酯聚集引起的肝脏性疾病。胰高血糖素样肽1（glucagon⁃like pep⁃tide 1，GLP⁃1）为内源性肠促胰岛素，可以提高胰腺β细胞的葡萄糖浓度分解胰岛素。据相关研究显示，人体的肝细胞内有GLP⁃1的受体，在Huh7的干细胞株培养液内添加GLP⁃1的受体后脂肪的产生会减少。利拉鲁肽是GLP⁃1的高度同源的类似物，和人体内GLP⁃1有96%序列的同源性。它可以让葡萄糖浓度的依赖模式来增加胰岛素的分解［1-2］。当体内血糖变高时，刺激胰岛素的分泌，胰高糖素的分泌被抑制。当血糖变低时，利拉鲁肽可以使胰岛素的分泌变少，且胰高糖素分泌不会受到影响。近期相关研究显示TLR4在炎症细胞中有表达，特别是在肝脏祖细胞、门静脉的巨噬细胞和胆管上皮细胞中表达最为显著，它和肝脏炎症反应联系紧密，还可以活化纤维化细胞。TLR4信号通路中有完整的表达，其中TLR4/NF⁃κB分支在NAFLD进展中起着重要作用，它调控肝脏的炎症反应、纤维化进程和肝细胞的凋亡［3］。因此，更进一步地研究药物对肝脏中TLR4/NF⁃κB信号通路的影响有利于了解药物对NAFLD进展影响。所以，本文对NAFLD大鼠模型用利拉鲁肽进行治疗，研究GLP⁃1对于NAFLD大鼠肝功能的影响，并研究其对TLR4/NF⁃κB的信号通路影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 5周龄的SD老鼠45只，体质量（110±20）g，由上海斯莱克动物实验有限公司提供。

1.2 实验试剂和仪器 主要试剂：利拉鲁肽（丹麦诺和诺德公司生产）、甘油三酯试剂（北京中生北控生物科技公司生产）、胆固醇试剂（北京中生北控生物科技公司生产）、BCA蛋白浓度测定制剂（碧云天公司生产）、高脂饲料（广东动物实验中心生产）。

主要仪器：苏州净化设备厂的超净工作台、低温台式离心机、MPG⁃13H的水浴箱、分光的光度计、制冰机、电泳仪、全自动的生化分析仪、德国Eppendorf 100～1 000 μL的可调微量移液器。

1.3 实验方法 将45只大鼠随机分成两组，正常饲料喂养15只，高脂饮食（普通饲料+100 g/kg猪油+20 g/kg胆固醇+100 g/kg蔗糖）喂养30只使其形成NAFLD模型。检测血清肝酶、血清TG、TC异常升高，肝组织HE染色有大量脂滴形成者可诊断为NAFLF造模成功。

在第10周，把高脂饲料喂养的28只老鼠随机分成两组，模型对照组（14只）和GLP⁃1干预组（14只）；正常饲料喂养的15只为正常对照组。

正常对照组：正常饲料喂养并每天在腹腔内注射0.7 mg/kg的生理盐水，持续4周；模型对照组：高脂的饲料喂养并每天在腹腔内注射0.7 mg/kg的生理盐水，持续4周；GLP⁃1干预组，高脂的饲料喂养并每天在腹腔内注射0.7 mg/kg的利拉鲁肽，持续4周。期间查看大鼠的活动、体质量、食欲、大小便等情况的变化。

1.4 指标检查 肝指数计算：肝指数（%）=肝湿质量/体质量×100%。肝功能和血脂的检查：采用全自动的生化检测仪检查总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、门冬氨酸氨基转移酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）。肝组织的蛋白含量检查：使用BCA法［4］测定微量的蛋白浓度；RT⁃PCR的方法［5］检查TLR4 mRNA的表达；Western blot法［6］检查TLR4的蛋白表达；免疫组化法［8］检查肝组织中NF⁃κB表达情况；

1.5 统计学方法 使用SPSS 16.0统计的软件来分析，计数资料使用表示，多组间对比使用单因素方差分析，方差齐者使用LSD检验，方差不齐者使用Welch校正法，计数资料使用Fisher精确检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况 在干预的过程中，正常对照组大鼠活动良好，皮毛整洁，饮食也正常；模型对照组的大鼠饮食变多，毛发变得凌乱，活动变少；GLP⁃1干预组的大鼠与正常对照组相似。

2.2 3组大鼠在肝指数、肝重量和体质量的变化情况 与正常对照组相比，模型对照组大鼠的肝指数和肝质量明显升高（P＜0.05），与模型对照组对比，用药4周后，GLP⁃1组大鼠的肝指数和肝重量明显下降（P＜0.05），见表1。

表1 三组大鼠的肝指数、肝重量和体质量变化情况对比Tab.1 The changes of liver index，liver weight and body mass in three groups of rats ±s

表1 三组大鼠的肝指数、肝重量和体质量变化情况对比Tab.1 The changes of liver index，liver weight and body mass in three groups of rats ±s

组别正常对照组模型对照组GLP⁃1干预组F值P值例数15 14 14大鼠体质量（g）359.93±50.02 355.72±35.74 355.41±22.63 2.894 0.632大鼠肝质量（g）7.94±1.31 12.04±1.27 8.97±1.29 2.105 0.026大鼠肝指数（%）22.91±1.49 31.03±3.51 26.85±3.17 1.671 0.031

2.3 3组大鼠血清肝功能及血清脂质变化情况与正常对照组相比，模型对照组中AST、ALT、TC、TG均明显上升（P＜0.05）；与模型对照组相比，GLP⁃1干预组在用药4周后，AST、ALT、TC、TG均明显下降（P＜ 0.05），见表2。

2.4 3组大鼠的病理改变情况 正常组大鼠肝脏的结果正常，肝小叶的结构显著，肝细胞索呈现出放射状的排列，细胞没有发现气球样的变性。模型组大鼠肝细胞重度水样变性、弥漫小泡性脂肪空泡变性，且细胞核被挤压变形，肝细胞索混乱，肝窦变狭窄或者消失，但没有发现明显的坏死、炎症和纤维化等状况。GLP-1干预组大鼠肝脏组织能够看见少量的脂肪水样变性，程度比模型对照组轻，见图1。

表2 3组大鼠血清肝功能及血清脂质变化情况比较Tab.2 Comparison of serum liver function and serum lipid in three groups of rats ±s

表2 3组大鼠血清肝功能及血清脂质变化情况比较Tab.2 Comparison of serum liver function and serum lipid in three groups of rats ±s

组别正常对照组模型对照组GLP⁃1干预组F值P值例数15 14 14 ALT（U/L）66.92±18.02 86.94±18.83 58.96±16.04 0.741 0.036 AST（U/L）97.74±45.05 175.74±29.71 123.69±25.06 0.964 0.021 TC（mmol/L）1.12±0.31 2.51±0.32 1.99±0.18 0.163 0.014 TG（mmol/L）0.60±0.17 1.96±0.81 1.32±0.46 0.904 0.032

图1 肝组织HE染色观察（×200）Fig.1 Liver tissue HE staining（× 200）

2.5 3组大鼠TLR4 mRNA表达、TLR4蛋白表达和NF⁃κB蛋白表达情况 由RT⁃PCR的结果显示，模型对照组和正常对照组对比，模型对照组mRNA的表达上升（P＜0.05），GLP⁃1干预组和模型对照组对比，GLP⁃1干预组mRNA的表达降低（P＜0.05）；Western blotting法检查结果显示（图2），与正常对照组比较，模型对照组的TLR4表达上升（P＜0.05），GLP⁃1干预组和模型对照组比较，TLR4的表达降低（P＜0.05）；免疫组化检测显示（图3），与正常对照组比较，模型对照组NF⁃κB的表达上升（P＜0.05），与模型对照组比较，GLP⁃1干预组NF⁃κB的表达降低（P＜0.05），见表3。

图2 TLR4蛋白表达条带图Fig.2 TLR4 protein expression band map

3 讨论

NAFLD为代谢综合征在肝脏上的表现，它是引发慢性肝病主要原因。约25%的NAFLD患者会演变为慢性肝炎，与肝脏肿瘤、肝硬化及门脉高压都有关系。现在此病的发病率逐步上升，但NAFLD演变为慢性肝炎机制仍不明确［7］。肝脏内TAG分解代谢的过程中主要是脂肪酸氧化及以极低密度脂蛋白的形式转运出肝细胞。无论是进食或者空腹，肝脏代谢所需的能量大部分均来自脂肪酸氧化，而该过程与肝脏的脂肪变性密切相关。相关研究认为肠道细菌会影响一些炎症受体TLR4、TLR9等通过门脉系统进入到肝脏导致肝脏炎症，所以通过扭转宿主和肠道菌群关系调整炎症受体表达可以扭转代谢性障碍导致肝脏炎症。NF⁃κB为多效性蛋白复合体，它在胞浆内是以没有活性形式而存在，与NF⁃κB抑制剂联合在一起。当受到细胞外面复杂信号作用，抑制剂会降解，NF⁃κB就以有活性形式进到细胞核内，这是可激活转录［8-9］。NF⁃κB激活在肝纤维化和肝脏炎症发展中有重要作用，它可保护肝脏细胞不受炎性因子诱导细胞死亡，与补偿肝细胞增殖反应来修复肝部损坏［10］。

表3 3组大鼠TLR4 mRNA表达、TLR4蛋白表达和NF⁃κB蛋白表达情况比较Tab.3 TLR4 mRNA expression，TLR4 protein expression and NF⁃κB protein expression in three groups ±s

表3 3组大鼠TLR4 mRNA表达、TLR4蛋白表达和NF⁃κB蛋白表达情况比较Tab.3 TLR4 mRNA expression，TLR4 protein expression and NF⁃κB protein expression in three groups ±s

组别正常对照组模型对照组GLP⁃1干预组F值P值例数15 14 14 mRNA 1.15±0.24 2.87±0.31 1.04±0.23 2.781 0.016 TLR4蛋白表达1.02±0.21 1.93±0.17 1.15±0.19 1.756 0.024 NF⁃κB蛋白表达8.23±1.72 62.51±10.73 24.77±5.83 1.904 0.012

本文经过高脂喂养建立了NAFLD的大鼠模型，表现出高脂血症。使用GLP⁃1的类似物（利拉鲁肽）进行4周的治疗后，GLP⁃1干预组和模型对照组比较，其肝功能ALT、AST，血清TG、TC都明显降低，和正常对照组接近。由此发现GLP⁃1类似物可以明显改善高脂饮食导致脂质代谢絮乱，对NAFLD大鼠可起到治疗作用，它主要是通过调整肝脏糖代谢扭转了胰岛素抵抗实现的。如果TLR4/NF⁃κB信号通路是炎症传播重要通道，那么GLP⁃1类似物对通路是不是有影响？经过本文研究发现，与正常对照组比较，模型对照组大鼠体内TLR4蛋白表达和NF⁃κB蛋白表达明显上升，与模型对照组比较，GLP⁃1干预组大鼠体内TLR4蛋白表达和NF⁃κB蛋白表达明显降低。由此认为GLP⁃1类似物（利拉鲁肽）能够有效降低高脂饮食诱导高表达炎症信号路通TLR4和NF⁃κB蛋白表达，对体内炎症内在机制有抑制作用。本文研究的对象是动物，所取标本为动物组织标本和人体的病理机制有一定差距，人体有效的临床研究有待进行，方可进一步验证利拉鲁肽在人体内对NAFLD的治疗作用。

图3 肝组织免疫组化结果（×200）Fig.3 Immunohistochemical results of liver tissue（× 200）

综上所述，GLP⁃1可明显扭转NAFLD大鼠的糖脂代谢絮乱和肝功能受损的情况，GLP⁃1可明显降低大鼠肝组织中TLR4和NF⁃κB的蛋白表达，是降低NAFLD的大鼠肝组织内炎症水平重要的机制之一。

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