鞘内注射TRESK过表达腺病毒抑制JNK活化和神经元凋亡减轻神经病理性疼痛

熊艳峰 林文静 林森 黄振兴 黄腾 王汉兵 杨承祥 仲吉英 周俊

佛山市第一人民医院麻醉科（广东佛山 528000）

神经病理性疼痛（neuropathic pain，NP）是由神经系统原发性损害和功能障碍所激发或引起的一种慢性疼痛，发病机制尚未完全阐明。离子通道改变形成异常放电的是NP痛觉异常主要原因，双孔钾离子通道TRESK（TWIK⁃related spinal cord potassium channels）在背根神经节（dorsal root gan⁃glion，DRG）中大量表达，TRESK下调可能参与多种慢性疼痛的病理生理过程［1-4］，本课题组的前期研究发现上调大鼠DRG的TRESK表达可明显减轻NP［5］，但具体机制尚不清楚。最近研究表明，神经元的凋亡与NP密切相关［6］，而c⁃Jun 氨基末端激酶（Jun N⁃terminal kinase，JNK）是MAPK通路的重要信号通路，在细胞周期、凋亡等多种生理病理过程中发挥重要作用，已被证明与NP密切相关［7］。本研究通过鞘内注射TRESK基因重组腺病毒载体：pAd/CMV/V5⁃DEST⁃TRESK［8］，上调NP大鼠DRG的TRESK表达，观察其对NP大鼠疼痛行为学以及DRG的JNK磷酸化和神经元凋亡的影响，进一步阐明TRESK介导的神经元凋亡参与NP的机制，为NP提供新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 动物选择及分组 雄性SD大鼠72只，体质量200～250 g，由广东省佛山市第一人民医院实验动物中心提供。采用随机数字表法，将其分为6组（n=12）：空白对照组（C组）、假手术组（S组）、神经病理性疼痛组（NP组）、TRESK过表达腺病毒组（T组）、阴性腺病毒组（V组）和生理盐水组（NS组）。NP组、T组、NS组和V组采用坐骨神经分支选择性损伤（SNI）大鼠模型。T组、V组和NS组于造模后分别在鞘内注射TRESK基因重组腺病毒（pAd/CMV/V5⁃DEST⁃TRESK）、阴性腺病毒和等容量生理盐水。

1.2 SNI模型的建立 NP组、T组、NS组和V组大鼠均取左侧行SNI模型［9］；S组手术操作与NP组相同，但不结扎神经。各组大鼠术后腹腔注射青霉素20万U预防感染。

1.3 鞘内注射 在大鼠的L4，5椎间隙进行鞘内注射：T组大鼠鞘内注射TRESK基因重组腺病毒pAd/CMV/V5⁃DEST⁃TRESK（109IU/mL），V 组大鼠鞘内注射阴性腺病毒，剂量均为25 μL；NS组大鼠鞘内注射生理盐水。

1.4 机械性缩足反射阈值（MWT）和热缩足潜伏期（TWL）测定 各组大鼠分别于术前1 d（BL）和术后1、3、7和14 d（D1、D3、D7、D14）分别测定左后肢MWT和TWL。用Von⁃Frey纤维丝（Stoelting公司，美国）测定MWT，测量5次，每次间隔10 min，取均值，该值即为机械痛阈值［10］。BME⁃40A型热痛刺激仪（中国医学科学院生物工程研究所）以热辐射法测定TWL，测量5次，每次间隔10 min［11］。

1.5 Western blot检测大鼠DRG的TRESK、p⁃JNK、JNK和Caspase3蛋白表达 于造模后7 d（D7）痛阈测定结束后，每组断头处死6只大鼠，分别取L4～5节段背根神经节组织；造模后14 d痛阈测定结束，每组断头处死剩余6只大鼠，分别取L4～5节段脊髓组织。组织均于-80℃保存，Western blot分别检测大鼠DRG的TRESK、Caspase3、p⁃JNK和JNK蛋白表达。

1.6 DRG凋亡细胞检测 TUNEL标记法检测DRG凋亡神经元细胞。造模后14 d（D14）痛阈测定结束，每组各取6只大鼠，10%水合氯醛麻醉下剖胸暴露心脏，经心尖部插管灌流固定，依次灌注生理盐水、4%多聚甲醛，取L4～5DRG组织置于30%多聚甲醛中固定24 h，常规石蜡包埋，横断5 μm连续切片。TUNEL染色后二甲苯透明中性树脂封片，光镜下观察并TUNEL阳性细胞（细胞核棕褐色染色）。每只大鼠取5张DRG切片，用奥林巴斯倒置显微镜（Olympus C7070wz，日本）观察，应用图像分析仪分析并计算细胞凋亡率（%）=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.7 统计学方法 用SPSS 10.0统计软件进行统计分析。计量资料以表示，组间比较采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MWT与TWL比较 各组各时点的TWL组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）；NP组、T组、V组、NS组D1、D3、D7、D14时的MWT明显低于C组、S组（P＜0.05）；与NP组、V组、NS组相比，T组D1、D3、D7、D14时的MWT的明显升高（P＜ 0.05）；T组、V组、NS组D1、D3、D7、D14时的MWT组间比较差异无统计学意义（P＞0.05，表1）。

2.2 各组大鼠DRG的TRESK蛋白表达比较 与C组、S组相比，NP组、V组和NS组L4～5术侧DRG的TRESK蛋白表达明显降低（P＜0.05）；TRESK组L4～5术侧DRG的TRESK蛋白表达明显高于NP组、V组、NS组（P＜0.05）；T组、V组、NS组的TRESK蛋白表达组间比较差异无统计学意义（P＞0.05，表2）。

表1 各组大鼠不同时点PWT和TWL的比较Tab.1 Comparation of PWT and TWL in each group rats at different time points ±s

表1 各组大鼠不同时点PWT和TWL的比较Tab.1 Comparation of PWT and TWL in each group rats at different time points ±s

注：与C、S组比较，aP ＜0.05；与NP、V、NS组比较，bP ＜0.05

MWT（g）TWL（s）组别C组S组NP组T组V组NS组BL 13.3±1.3 13.4±1.8 13.6±1.6 13.7±1.2 13.8±1.4 13.0±1.7 D1 13.4±1.0 13.9±1.9 8.5±1.1a 10.7±1.3ab 8.7±1.3a 8.4±1.0a D3 13.2±1.5 13.5±1.2 6.2±1.0a 8.8±1.2ab 6.0±0.8a 6.1±1.0a D7 13.2±1.0 13.5±1.3 5.1±0.9a 8.0±1.6ab 5.0±0.8a 5.2±1.0a D14 13.6±1.3 13.3±0.8 4.9±1.1a 8.5±1.3ab 4.8±0.8a 5.0±1.1a BL 17.7±2.0 17.6±1.6 17.5±2.1 18.0±2.1 17.9±2.1 17.3±2.0 D1 17.9±2.0 17.7±2.0 17.8±1.8 17.5±1.6 17.8±1.7 17.4±2.0 D3 17.3±1.6 17.5±2.2 17.3±2.0 17.8±1.3 17.3±1.2 17.6±1.6 D7 17.5±2.0 17.1±1.6 17.6±2.1 18.2±2.3 17.9±2.0 17.4±1.3 D14 17.7±2.2 17.0±1.8 17.2±1.8 17.3±2.2 17.7±2.4 17.0±1.8

表2 各组大鼠背根神经节组织TRESK蛋白表达的比较（n=6）Tab.2 Comparation of TRESK expression in DRG of each group rats ±s

表2 各组大鼠背根神经节组织TRESK蛋白表达的比较（n=6）Tab.2 Comparation of TRESK expression in DRG of each group rats ±s

注：与C、S组比较，aP ＜0.05；与NP、V、NS组比较，bP ＜0.05

指标C组S组NP组T组V组NS组TRESK蛋白1.34±0.11 1.41±0.13 0.41±0.08a 1.05±0.21b 0.37±0.15a 0.44±0.16a

表3 各组大鼠DRG的JNK磷酸化水平比较（n=6）Tab.3 Comparation of JNK phosphorylation in DRG of each group rats ±s

表3 各组大鼠DRG的JNK磷酸化水平比较（n=6）Tab.3 Comparation of JNK phosphorylation in DRG of each group rats ±s

注：与C、S组比较，aP ＜ 0.05；与NP、V、NS组比较，bP ＜0.05

指标C组S组NP组T组V组NS组p⁃JNK/JNK 0.13±0.04 0.15±0.05 1.21±0.13a 0.76±0.08ab 1.32±0.15a 1.26±0.12a

表4 各组大鼠DRG神经元凋亡比较（n=6）Tab.4 Comparation of neuronal apoptosis in DRG of each group rats ±s

表4 各组大鼠DRG神经元凋亡比较（n=6）Tab.4 Comparation of neuronal apoptosis in DRG of each group rats ±s

注：与C、S组比较，aP ＜ 0.05；与NP、V、NS组比较，bP ＜0.05

指标C组S组NP组T组V组NS组Caspase⁃3蛋白0.42±0.04 0.38±0.05 1.38±0.12a 0.86±0.07ab 1.32±0.16a 1.27±0.18a细胞凋亡率（%）0.97±0.03 1.01±0.04 41.23±5.16a 19.82±4.33ab 44.17±6.18a 40.16±5.73a

2.3 各组大鼠DRG的JNK磷酸化比较 与C组、S组相比，NP组、T组、V组和NS组L4～5DRG的JNK磷酸化水平明显增高（P＜0.05）；与NP组、V组、NS组相比，T组L4～5DRG的JNK磷酸化水平明显降低（P＜ 0.05）；T组、V组、NS组的L4～5DRG的JNK磷酸化水平组间比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

2.4 各组大鼠DRG神经元凋亡比较 与C组、S组相比，NP组、T组、V组和NS组L4～5DRG的细胞凋亡率和Caspase⁃3表达明显增高（P＜ 0.05）；与NP组、V组、NS组相比，T组L4～5DRG的细胞凋亡率和Caspase⁃3表达明显降低（P＜ 0.05）；T组、V组、NS组的L4～5DRG的细胞凋亡率和Caspase⁃3表达组间比较差异无统计学意义（P＞0.05，表4）。

3 讨论

SNI动物模型的特点是具有显著异常机械痛敏，但无热痛阈变化。该模型更接近NP的临床特征，是一种较理想的NP模型。本研究制备SNI模型可重复性高，与前期研究行为学一致［5］：各组大鼠均在术后1 d即开始表现为机械痛敏，而并不表现热痛超敏，符合SNI模型典型的行为学特征。

双孔钾离子通道亚型TRESK在大鼠DRG大量表达，主要功能是维持神经元细胞的静息电位，在神经元细胞的兴奋过程中起重要作用。本课题组前期研究构建的TRESK基因重组腺病毒载体pAd/CMV/V5⁃DEST⁃TRESK，已证明在离体和在体均具有可靠的转染效率和上调TRESK目的基因的效果［11-12］。本试验所有实施SNI手术的组别TRESK蛋白均下调，而给予pAd/CMV/V5⁃DEST⁃TRESK的TRESK大鼠背根神经节的TRESK的表达明显上调。另外，与NP组比较，T组的MWT升高，再次验证了上调SNI大鼠DRG的TRESK表达可减轻大鼠NP。

NP脊髓水平的神经元的凋亡、炎性反应，已被多个研究证实在NP中发挥重要作用，多型NP均伴有背根神经节和脊髓神经元的凋亡［13］，其机制可能为：抑制性中间神经元的凋亡减少了其对伤害性信息传递的抑制作用，导致背根神经节向脊髓传导的痛觉伤害性神经元兴奋增高，从而产生痛觉过敏［14］。而JNK是介导MAPK磷酸化的重要信号通路，也介导了炎症反应和凋亡的过程，因此，笔者推测JNK与NP之间有联系。同时，已有学者认为脊髓水平的MAPK磷酸化通过调节炎性反应和神经元凋亡参与了慢性疼痛的机制［15］。本研究观察了SNI大鼠TRESK下调对DRG凋亡神经元的影响，结果SNI大鼠伴随着DRG的TRESK下调，凋亡细胞和凋亡相关蛋白Caspase⁃3明显上调，而上调DRG的TRESK表达后，SNI大鼠的凋亡明显减轻，说明神经元的凋亡介导了NPDRG的TRESK机制，也证实TRESK是下游通路，通过介导JNK信号来发挥作用。

细胞内钾离子外流是细胞凋亡的重要特征之一。在许多病理条件下，胞内钾离子浓度降低可以引起神经元凋亡，钾通道阻断剂或胞外高钾可以阻断神经元凋亡。钾离子通道TRESK是DRG最主要的背景钾离子通道，DRG的TRESK下调改变神经元兴奋性，通过突触传递等方式将疼痛信号传递到中枢，参与多型疼痛的发病机制。JNK在细胞周期、凋亡等多种生理病理过程中发挥重要作用，与NP密切相关［6］，而TRESK参与的慢性疼痛机制也与JNK、神经元凋亡有相关性。结合本试验中DRG的JNK磷酸化结果，笔者推测在NP发病机制中，DRG的TRESK通过JNK磷酸化引起神经元凋亡，从而介导了痛敏的发生。

综上所述，TRESK介导大鼠的神经病理性痛机制可能与背根神经节JNK磷酸化和神经元凋亡有关。本实验验证了K+通路TRESK在NP中发挥了重要的作用，并且其介导了下游通路。在今后的临床工作中，通过特异性离子通道抑制剂、信号下游通道的抑制剂或激动拮抗剂来达到治疗NP的效果，也是今后的研究方向［16］。

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