绿色荧光蛋白转基因大鼠脂肪间充质干细胞的培养及分化潜能鉴定

范友芬，潘艳艳，乐欣，晋国营，虞耀华

脂肪间充质干细胞（ADSCs）是一类来源于脂肪组织并具有多向分化潜能的干细胞，广泛分布于各物种不同部位的脂肪组织中，具有骨髓间充质干细胞相似的表型和多向分化能力。ADSCs具有数量巨大、取材容易且获取率高、体外扩增快、细胞老化率低及免疫原性低等特点[1]，还具有血管原性和抗炎活性，能促进组织新生血管形成[2]。这使得同种异体之间的ADSCs移植变为可行，且具有广泛的临床应用前景。刘相名等[3]从SD大鼠的脂肪组织中获得了ADSCs，并向脂肪细胞、成骨细胞进行了诱导，体外可稳定表达外源基因，证明了其可作为自体移植的一种细胞来源和基因治疗的一种载体。

绿色荧光蛋白（GFP）是在荧光示踪技术中广泛应用标记细胞的一种蛋白，具有高效、稳定、无细胞毒性及检测方便等优点[4]。GFP转基因大鼠可系统性表达GFP，可以利用光学成像技术跟踪靶细胞，广泛用于研究干细胞领域。本研究拟建立一种GFP转基因大鼠ADSCs的分离、培养及纯化的的方法，并对其细胞表型和多向分化潜能进行鉴定，以期为后续ADSCs应用于大鼠烧伤创面修复的研究提供基础[5]。报道如下。

1　资料与方法

1.1材料 SPF级雌性GFP转基因大鼠3只，4～5周龄；实验级雌性SD大鼠3只，4周龄；均购于宁波大学实验动物中心。FBS高糖DMEM全培、干细胞完全培养液、成脂诱导液A、成脂诱导液B及成骨诱导液，均为美国Thermo公司产品；PBS、Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶、抗大鼠CD34PE、CD90FITC、CD44PE、CD45PE、CD29PE单抗、PE-IgG1、FITC-IgG1、茜素红染色剂及油红O染色剂等其他试剂，大连TaKaRa公司产品；流式细胞分析仪（贝克曼navios，美国）；CO2培养箱（美国Thermo公司）；倒置显微镜、倒置荧光显微镜（日本Olympus公司）。

1.2方法

1.2.1大鼠ADSCs的分离、培养 （1）ADSCs的分离：取GFP转基因大鼠，腹腔注射5%水合氯醛麻醉，麻醉满意后行腹部、双下肢消毒，无菌超净工作台内作腹部正中切口并向双侧腹股沟内侧分离，取双侧脂肪组织并剥除血管组织，缝合切口；以无菌PBS冲洗取出的脂肪组织3次后，再用眼科剪将其剪碎至糊状，装入50 ml无菌离心管中。加入2～3倍体积的用PBS预配的1%Ⅱ型胶原酶，37℃振荡消化30min，直至脂肪组织呈乳糜状。离心沉淀5 min后小心取中层液体过200目细胞筛后，按1∶3比例加入10%FBS高糖DMEM全培终止反应，种于培养瓶内，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。（2）ADSCs的培养：ADSCs分离后第2天PBS冲洗，全量换液，10%FBS高糖DMEM全培培养，根据细胞生长情况，2～3 d换液1次，倒置显微镜下观察细胞形态变化。待细胞生长至80%～90%融合时进行传代。倒置荧光显微镜观察第3代ADSCs的荧光强度衰减情况。

1.2.2大鼠ADSCs的细胞流式表型鉴定 取第3代的ADSCs，用胰蛋白酶进行消化，将其制备成单细胞悬液。1×106/ml细胞分别加入抗大鼠 CD34PE、CD90FITC、CD44PE、CD45PE、CD29PE单抗各1l，PEIgG1、FITC-IgG1为阴性对照。4℃避光孵育30 min，以流式细胞分析仪检测细胞表型。

1.2.3大鼠ADSCs向成骨细胞、成脂细胞诱导分化及鉴定 （1）成骨细胞诱导及鉴定：待ADSCs达到80%～90%融合时，用胰蛋白酶消化后将其接种于6孔板中，每孔约3×103个细胞，按2ml/孔剂量加入干细胞完全培养液，放入温度37℃、5%二氧化碳孵箱中培养，24 h后移去培养液，按2 ml/孔剂量加入成骨诱导液；每3天换液1次，如此诱导2～3周；待钙结节形成。成骨诱导后的ADSCs用10%甲醛固定1h，70%异丙醇清洗，加入0.1%的茜素红染色10min，用PBS冲洗，倒置光学显微镜下观察并记录。（2）成脂细胞诱导及鉴定：待ADSCs达到80%～90%融合时，用胰蛋白酶消化后将其接种于6孔板中，每孔约2×104个细胞，按2 ml/孔剂量加入干细胞完全培养液，放入温度37℃、5%二氧化碳孵箱中培养、每3天更换干细胞完全培养液，直至细胞达到100%融合。随后移去培养液，按2ml/孔剂量加入成脂诱导液A开始诱导，3d后更换为成脂诱导液B维持，24h后再次更换为成脂诱导液A诱导，如此循环3次；当细胞内脂滴数量增多，但体积相对较小时，可用成脂诱导液B维持3～5d，至脂滴增大。成脂诱导后的ADSCs用10%甲醛固定1h，70%异丙醇清洗，加入2%油红O染色10min，用PBS冲洗，倒置光学显微镜下观察并拍照记录。

1.2.4伤口创面示踪检测 将SD大鼠按照文献[6]方法制备大鼠皮肤深度烧伤模型，取ADSCs细胞悬液（浓度为1×106个/ml）多点注射于大鼠背部创面及创周皮下，在术后21 d时处死大鼠，常规消毒铺单，沿大鼠背部创面范围用无菌手术剪剪开皮肤，充分游离皮下后取下双侧创面皮肤组织，常规冷冻切片，荧光显微镜下观察细胞定植情况。

2　结果

2.1ADSCs的分离与培养 成功完成大鼠ADSCs的分离、培养，采用酶消化法得到的ADSCs，1次传代后在显微镜下观察，细胞呈梭形细胞生长，原代及2代细胞还有少量血细胞混杂，到第3代则较前明显纯净（封二彩图1），细胞高度表达GFP（封二彩图2）。3～10代内细胞基本按对数生长，形态均一。

2.2ADSCs的鉴定 取P3代ADSCs对其表面特异性标记物进行检测，流式细胞仪鉴定示：所扩增ADSCs高表达间充质干细胞标记物CD29、CD90及CD105；对于造血干细胞表面标记物CD34、白细胞共同抗原CD45则呈现低表达，细胞表面标志物的表达与相关文献报道基本一致（封二彩图3）。

2.3ADSCs多向分化能力鉴定 经过21 d的成骨分化、成脂细胞分化实验，实验结果显示：成骨诱导的细胞在茜素红染色后出现了深色钙结节，显示为成骨细胞分化阳性（封二彩图4）。成脂诱导的细胞在油红O染色后，可见胞浆内有大小不一的橘黄色脂滴（封二彩图5），显示为成脂分化阳性。

2.4伤口创面示踪检测结果 将ADSCs细胞悬液多点注射于大鼠背部创面及创周皮下21 d后，创面冷冻切片荧光显微镜下可见散在点状绿色荧光（封三彩图1）。

3　讨论

ADSCs作为生物成体间充质干细胞的一种，其具有多向分化潜能，如分化为脂肪、骨、软骨、骨骼肌、平滑肌、心肌、表皮、肝细胞、造血细胞以及神经元细胞等[6-7]。本实验中分离培养出的GFT转基因大鼠的ADSCs具有良好的分化能力，可向成脂、成骨分化。

据文献报道，大鼠腹股沟处皮下脂肪垫是用于提取ADSCs最佳的取材部位，与背部、颈部、附睾、肠系膜及腹腔相比[8-9]，此处脂肪组织最为丰富，便于分离更多的ADSCs，只要尽可能剔除其中的血管和筋膜，避免过多的杂细胞混入就能提取出较纯的ADSCs。本实验在取材时选取GFT转基因大鼠腹股沟处皮下脂肪垫。本实验采用酶原消化并差速贴壁的方法成功分离培养ADSCs。因红细胞有不贴壁的特性，待ADSCs贴壁后，便可以通过换液去除混杂的红细胞的方法来替代裂解液的使用，这样也避免了裂解液对ADSCs的损伤和影响[10]。同时通过换液和消化传代可以去除漂浮的脂滴和杂细胞，使细胞得以纯化。在培养过程中，见ADSCs呈长梭形、漩涡样生长，传代后细胞生长增殖速度快，连续传至10代细胞形态均无明显变化。

ADSCs具有间充质干细胞这一类细胞的特异性表面标记，表达大量的黏附分子，如持续表达CD9、整合素 1和4、细胞间黏附分子1、CD105、血管细胞黏附分子和活化淋巴细胞粘附分子，表达Ⅰ类组织相容性蛋白HLA-ABC，但ADSCs并不表达造血细胞表面标志如CD14、CD34或CD45，不表达Ⅱ类组织相容性抗原 HLA-DR及内皮细胞标志CD31，不表达共刺激因子B7-1、B7-2和CD40。ADSCs不表达MHC2Ⅱ类分子和B7-1、B7-2和CD40等共刺激分子，这样会导致效应性T细胞无法激活，使辅助性T细胞无反应性而促成免疫耐受，从而表现出这一更为重要的生物学特性—低免疫原性，这就使同种异体ADSCs移植变为可能，从而摆脱了必须自体干细胞回植的局限，大大提高了实用性。本实验中，流式细胞分析结果证明分离出的ADSCs表面标志物符合相关文献报道[11]。

近年来，用于细胞标记示踪的方法主要有荧光染料标记法、GFP标记法、核酸标记法及Y染色体标记法等[12]，各有优缺点。GFP是来自于南太平洋水母中的一种新型报告基因，具有特异性高、高效稳定、无细胞毒性、检测方便等优点[4]，适于标记和示踪细胞。GFP转基因大鼠可系统性表达GFP。我国有研究者成功分离培养出了 GFP转基因大鼠的骨髓间充质干细胞[4]、神经干细胞[13]及胚胎神经上皮干细胞[14]等，也有研究者采用GFP转染法标记大鼠骨髓间充质干细胞[15]，均证明GFP标记细胞简单易行，对细胞无毒性，具有良好的应用前景。但传统的示踪方法是在离体状态下通过慢病毒或质粒转染荧光染料来鉴定，且转染效率难以控制，可能会对干细胞的增殖、分泌、分化功能有影响。GFP转基因纯合子大鼠的所有体细胞均能稳定表达绿色荧光，因此本实验采用提取GFP转基因大鼠的ADSCs，用于后续的烧伤创面修复的研究，对明确外源性ADSCs在其中的作用及机制具有重要意义。本实验结果显示，从GFP转基因大鼠提取的ADSCs能稳定表达GFP，荧光显微镜下可见第3代细胞几乎全部散发绿色荧光，细胞移植于烧伤创面后21 d，依然在皮肤创面切片上可见散状绿色荧光，证明了示踪效果好。

综上所述，运用酶原消化并差速贴壁的方法可获取纯度高、生长增殖能力强和具有多向分化潜能的GFP-ADSCs，来源于GFP转基因大鼠的ADSCs可高度稳定表达GFP，且简单易行，活体移植，定植效果良好，可作为标记和示踪大鼠脂肪间充质干细胞的蛋白。

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