Runx-2转染骨髓间充质干细胞复合纳米羟基磷灰石修复兔桡骨骨缺损效果观察

李庆庆，廖福朋，桂先革，黄江鸿，王大平

大面积骨缺损可由创伤、肿瘤、感染及先天发育不良等所致，是骨科常见的疾病，也是治疗的难题。目前的人工骨材料难以有效治疗大面积的骨缺损。通过整合骨材料、成骨干细胞及成骨活性因子等提高人工骨材料的成骨活性是目前骨组织生物工程的研究重点[1]。骨髓间充质干细胞（BMSCs）作为种子细胞，在骨修复与重建中可分化为成骨细胞、骨细胞和软骨细胞，促进骨愈合[2]。Runx-2在成骨分化的信号途径中起核心作用，能诱导BMSCs向成骨细胞定向分化并成熟，从而促进骨愈合[3-4]；纳米羟基磷灰石（nano HA）是目前应用广泛的一种生物活性材料，具有良好的骨传导性和生物相容性。本实验利用重组Runx-2基因的慢病毒感染 BMSCs，将Runx-2BMSCs与nano HA共培养，并用于兔桡骨骨缺损模型，研究 Runx-2 BMSCs-nano HA成骨活性。现报道如下。

1　资料与方法

1.1实验动物及主要试剂、仪器Runx-2慢病毒表达质粒、nano HA人工骨由深圳市第二人民医院组织工程实验室制备提供；人胚肾细胞（293T细胞）、人非小细胞肺癌细胞（NCI-H1299）购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；新西兰大白兔由深圳市疾病预防控制中心提供；慢病毒包装系统购于美国GeneCopoeia广州复能基因有限公司；Anti-CD90/FITC，Anti-CD105/FITC，PCR试剂盒、番红、苏木精及快绿购于Sigma公司；DMEM-HG、MEM、LB液体培养基、RPMI-1640、双抗、FBS、噻唑蓝及二甲基亚砜购于GIBCO公司；CO2孵育箱(Thermo公司，美国)；倒置相差显微镜（Lecia公司，德国）、荧光显微镜(Olympus公司，日本)；PCR扩增仪(Thermo公司，美国)；凝胶成像系统（Lifetech公司，美国）。

1.2方法

1.2.1Runx-2慢病毒的包装、滴度检验将 Runx-2慢病毒载体质粒和包装质粒共转染293T细胞，进行Runx-2慢病毒的重组、扩增与纯化。重组的慢病毒感染H1299细胞，计算出获得病毒液的滴度（MOI），MOI=平均荧光数×细胞总数/实际添加的病毒液体积（ml），其中前期实验中确定MOI值为50。

1.2.2兔BMSCs的分离、培养及鉴定将2个月龄新西兰大白兔用10%水合氯醛腹腔麻醉，麻醉成功后备皮、消毒、铺巾，用预混肝素的穿刺针在股骨中上段多点行骨髓穿刺。穿刺液用PBS液进行洗涤、离心，细胞悬液加入DMEM高糖培养基（含胎牛血清10%，双抗1%）培养24 h后轻柔洗去悬浮细胞；48h后再次冲洗悬浮细胞。待细胞长满培养皿底后用0.25%胰酶消化、传代。镜下观察培养细胞的形态特征，并用流式细胞仪检测BMSCs阳性表面标记物CD90和CD105。

1.2.3Runx-2慢病毒转染兔BMSCs取 P3生长状态良好，处于对数期的BMSCs细胞，制备细胞悬液，根据病毒滴度及MOI值准确计算病毒量。实验组中加入4ml病毒液，对照组中加入4ml eGFP病毒液，空白组中加入4 ml培养液，培育48 h。

1.2.4Runx-2 BMSCs的鉴定 分别将Runx-2BMSCs，eGFP-BMSCs，BMSCs培育 1周，1周后行 RT-PCR，检测Runx-2基因表达。

1.2.5兔桡骨骨缺损模型制备及植入实验材料

1.2.5.1制备材料 将nano HA材料裁剪为13 mm×4 mm×4 mm 大小，反复75%乙醇溶液消毒、PBS冲洗后，将nona HA与BMSCs共培养24 h。取制备的Runx-2 BMSCs离心、重悬细胞，调整细胞浓度为1×105/ml，将细胞液种植于制备的 nona HA材料表面，使 Runx-2 BMSCs与nano HA充分复合，设为实验组（A组）。同法制得eGFP-BMSCs-nano HA为B组，BMSCs-nano HA为C组。

1.2.5.2动物模型制作 取40只健康6个月龄新西兰大白兔，随机分为A组、B组、C组及空白组。予10%水合氯醛腹腔麻醉，麻醉成功后，常规备皮、消毒、铺巾，桡骨中段做纵行切口，直至骨膜，用线锯截骨制成约15 mm桡骨骨缺损模型，同时去除依附骨膜及周边骨膜，并分别植入Runx-2 BMSCs-nano HA（A组），eGFP-BMSCs-nano HA（B 组），BMSCsnano HA（C组），空白组不植入材料，皮肤全层缝合，无菌敷贴覆盖。分笼饲养，自由活动。观察兔的状态及伤口愈合情况。分别于术后4、8及12周分别对手术部位行X线检查。术后12周空气栓塞法处死实验兔，完整取出桡骨标本，甲醛固定后制备病理切片，行HE染色观察骨缺损恢复情况。

2　结果

2.1慢病毒滴度检验（荧光法） 荧光显微镜下，每孔随机抽取10个视野范围，数出荧光细胞数。测得Runx-2慢病毒滴度为4.8×109TU/ml，F组为空白对照组，荧光显微镜下未发现绿色荧光细胞（封三彩图2）。

2.2兔BMSCs的镜下形态 重悬浮后镜下可见大量圆形悬浮细胞。24h培养后，部分细胞开始贴壁生长，仍有大量细胞悬浮生长，PBS液轻柔洗去悬浮细胞；72 h后贴壁细胞呈梭形、多角形，有伪足，呈集簇生长；P3细胞形态趋于稳定，可呈长梭形、纺锤形，细胞分布均匀，无集簇生长现象（封三彩图3）。

2.3BMSCs流式细胞仪鉴定 取 P3 BMSCs进行细胞鉴定。选用BMSCs较特异的抗原CD90、CD105作为鉴定抗原。两者抗原阳性率分别为 99.4%、99.2%，均超过 99%。鉴定结果符合BMSCs特征（封三彩图4）。

2.4Runx-2BMSCs细胞Runx-2基因的表达 Runx-2慢病毒感染BMSCs1周，可见 Runx-2 BMCSs组 Runx-2表达较强，而eGFP-BMSCs及BMSCs组均未见明显Runx-2基因表达（封三彩图5）。

2.5实验兔的形态 实验兔术后 1周内活动减少，1周后逐步恢复活动能力，伤口辅料少许渗血，1周后拆线，未见实验兔伤口感染、坏死，实验兔死亡等情况。术后12周A组桡骨骨缺损已被正常骨所取代，表面连接平整，质地坚韧，未见软组织长入；B、C组可见缺损部位骨材料已完全吸收，骨组织已连接两端，但原缺损处有部分软组织长入，未完全修复；空白组可见部分新生骨组织形成骨连接，大部分骨缺损处为软组织替代，剔除软组织可见愈合仅占桡骨1/3～1/2（封三彩图6）。

2.6术后4、8及12周X线表现 A组术后4周 X线表现为复合材料出现吸收，材料与骨组织间无明显间隙，过渡区呈高密度影，表明骨细胞在复合材料中矿化；8周时材料进一步降解，可见材料由外向内分解吸收，整个缺损区域出现高亮影，外侧有骨桥连接；12周时复合材料已基本吸收，骨皮质连续，骨髓腔通畅，可见仍有部分骨痂存在。B、C组4周时可见材料部分吸收，材料与骨组织间出现间隙；8周时材料逐步降解，部分材料已被骨痂组织所取代，部分材料仍未出现矿化迹象；12周时仍有少量材料存在于骨组织间隙，骨皮质已连续，但骨痂较多，髓腔未通。空白组4周时未见断端间组织钙化；8周时断端出现增生改变；12周断端出现硬化迹象，部分皮质连续断端软组织未见钙化形成（封三彩图7）。

2.7病理观察 A组：骨皮质、骨松质形成，分布较规整，其中可见大量成骨细胞及部分纤维细胞，可见骨髓组织，未见nona HA材料。B、C组：未见明显nona HA材料，可见骨组织、结缔组织及髓腔组织，其中骨组织量少而分布不规则，内可见多量成骨细胞，可见大量纤维结缔组织。空白组：缺损区域以纤维结缔组织为主，大量纤维细胞，未见骨组织长入（封三彩图8）。

3　讨论

Runx-2在成骨分化的信号途径中被认为具有核心作用，能够诱导BMSCs向成骨细胞定向分化，并促成骨细胞和软骨细胞成熟，从而促进骨愈合[3-4]。在成骨分化的调节过程中，有多种活性因子直接参与成骨分化的调节，包括 BMP-2、BMP-4、BMP-7，TGF-1、TGF-2及IGF1等，但这些上游信号因子均与Runx-2存在相互作用，他们通过不同的信号通路使Runx-2基因表达上调，或使Runx-2蛋白磷酸化，调节其活性和功能，进一步调节BMSCs的成骨分化。在本实验的前期实验中，已制备Runx-2慢病毒质粒，并验证Runx-2重组慢病毒感染BMSCs可调高BMP-2、OCN、ALP、OPN及osteonectin等成骨活性因子的表达，说明Runx-2具有促进其成骨分化的能力[5]。

支架材料作为干细胞依附生长，并植入体内的介质显得尤为重要[6]。在既往的实验中，骨支架材料仅仅被作为工程骨提供结构支持，包括金属、陶瓷、人工或天然的高分子材料及复合材料等。这些支架材料最大的问题，就是与种子细胞的相容性不佳，或是种子细胞难以依附在其表面；或是种子细胞不能在其间诱导血管长入；或是种子细胞不能在其间形成正常骨组织。本研究选用的支架材料为nano HA，是因为nano HA与人体骨骼的无机成分相同，具有相当好的生物相容性[7]。羟基磷灰石粗糙的表面使BMSCs能够依附、增殖、迁移；纳米级材料扩大了材料的有效表面积，能够吸附更多的BMSCs；更多的孔径可以使BMSCs诱导血管长入。同时在骨的愈合过程中，nano HA逐渐被吸收，吸收的材料释放钙质，进一步被成骨细胞所利用，促进成骨作用。在本实验X片中可以看到成骨作用并非由外到内，而是内外同时出现成骨现象。可以解释为在体外nano HA与Runx-2 BMSCs共培养时已充分接种，同时大量的孔径能够使营养物质进入到nano HA内部，允许内部的BMSCs增殖、分化，并最终成骨[8]。

骨缺损模型的制作也是本研究的难点之一。在实际医疗环境中，需要大面积异体骨移植的患者往往骨缺损较大，软组织条件较差。而在动物模型上难以完全模拟这一情况，因此需要适当增大缺损骨面积，去除利于骨愈合的软组织[9]。本研究选用的是兔桡骨缺损模型，桡骨与尺骨相连，故术后无需内固定亦可正常活动，既简化了手术步骤，也减少了手术风险，减少了实验动物的损耗[10]。Bighamsadegh等[11]认为兔的桡骨缺损模型达到1～12mm较为合理，而本实验中将缺损模型定为15 mm，考虑需适当加大缺损体积，避免自行愈合可能。同时，笔者在实验过程去除缺损段骨膜及上下缘部分骨膜，模拟软组织缺损情况[12]。在实验结果中，空白组不能自行愈合骨缺损，说明骨缺损模型是合适的。

尽管nano HA有诸多好处，但强度低、脆性大及不耐疲劳等影响着其在临床中的应用；而骨缺损的患者往往需要更长的卧床时间，更长的非负重时间，这在一定程度上减少了nano HA的劣势。尽管如此，一种具有良好生物相容性，又具有高强度、可降解的骨材料生物支架是本实验组后期所需要研究的。

参考文献：

[1] 王呈,曾炳芳.骨移植替代材料在创伤骨科的应用[J].国际骨科学杂志,2012,33(1):37-38.

[2]Bo-Nian Lin,Shu Wen Whu,Chih-Hwa Chen,et al.Bone marrow mesenchymal stem cells,platelet-rich plasma and nanohydroxyapatite-type Icollagen beadswere integral partsof biomimetic bonesubstitutes for bone regeneration[J].Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine,2013,7(11):841-854.

[3]Carbonare LD,Innamorati G,Valenti MT.Transcription Factor Runx-2 and its Application to Bone Tissue Engineering[J].Stem Cell Reviews and Reports,2012,8(3):891-897.

[4] 李庆庆,黄江鸿,何关健,等.Runx-2及其在骨组织工程中的应用[J].国际骨科学杂志,2014,35(1):44-46.

[5] 李庆庆,王大平,熊建义,等.Runx-2重组慢病毒感染骨髓间充质干细胞并促进其成骨分化的研究[J].中国临床解剖学杂志,2015,33(3):311-315.

[6] Webster TJ,Ergun C,Doremus RH,et al.Enhanced osteoclast-likecell functionson nanophaseceramics[J].Biomaterials,2001,22(11):1327-1333.

[7] Nishida J,Shimamura T.Methods of reconstruction for bone defect after tumor excision:areview of alternatives[J].Medical Science Monitor International Medical Journal of Experimental&Clinical Research,2008,14(8):107-113.

[8]Kaigler D,Wang Z,Horger K,etal.VEGF Scaffolds Enhance Angiogenesisand Bone Regeneration in Irradiated Osseous Defects[J].Journal of Bone&Mineral Research,2006,21(5):735-744.

[9]Kang SH,Chung YG,Oh IH,et al.Bone regeneration potential of allogeneic or autogeneic mesenchymal stem cells loaded onto cancellousbonegranulesin arabbit radial defect model[J].Cell and Tissue Research,2014,355(1):81-88.

[10]Rathbone CR,Guda T,Singleton BM,et al.Effect of cell-seeded hydroxyapatite scaffolds on rabbit radius bone regeneration[J].Journal of Biomedical Materials Research,2014,102(5):1458-1466.

[11]Bighamsadegh A,Karimi I,Shadkhast M,et al.Hydroxyapatite and demineralized calf fetal growthplateeffectsonbonehea-ling in rabbit model[J].Journal of Orthopaedics and Traumatology,2015,16(2):141-149.

[12]Zhang YD,Wang G,Sun Y,et al.Combination of platelet-rich plasma with degradablebioactiveborateglassfor segmental bone defect repair[J].Acta Orthopaedical Belgica,2011,77(1):110-115.